波兰欧亚野兔（Lepus europaeus Pall. 1778）中EBHSV与RHDV2血清学暴露证据：兔病毒属-宿主互作及种群动态的启示

《Biology》：Serological Evidence of Exposure to EBHSV and RHDV2 in Brown Hare (Lepus europaeus Pall. 1778) in Poland: Insights into Lagovirus-Host Interaction and Population Dynamics

　　

专业术语翻译（摘要部分） 欧洲野兔种群的长期衰退与环境和人为因素均有关联。在影响兔形目（lagomorphs）种群动态的诸多因素中，兔病毒属病毒（lagoviruses）发挥着重要作用。本研究评估了波兰野兔的种群指标及针对欧洲野兔综合征病毒（European brown hare syndrome virus, EBHSV）和兔出血症病毒2型（rabbit haemorrhagic disease virus 2, RHDV2）抗体的存在情况。研究人员共检查了来自5个种群密度足以支持狩猎管理区域的109个个体。研究评估了种群指标，并使用单克隆抗体的酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗体的存在情况。野兔的体重在各区域间相近，但在幼体和成体间差异显著。种群增长率呈正值，而繁殖率相对较低。在全部5个区域均检测到针对EBHSV的特异性抗体，总体血清阳性率为78.9%，表明所研究野兔群体中该病毒既往暴露广泛。在10.1%的个体中检测到RHDV2反应性抗体。鉴于交叉反应和个体免疫应答的风险，有关RHDV2的结果应被视为可能暴露的血清学证据，有待进一步研究。研究结果为所检测野兔种群中兔病毒属病毒暴露提供了血清学证据，即使在种群密度足以支持狩猎管理的区域也是如此。这些结果强调了将传统种群指标与血清学监测相结合的综合野兔种群监测的重要性，尤其是针对EBHSV和RHDV2等兔病毒属病毒。

论文解读

一、研究背景与目的

欧洲野兔（Lepus europaeus）是兔形目最具代表性的物种之一，曾广泛分布于欧洲各地，在农业和开放生态系统中发挥着重要作用，是食物网的重要组成部分和环境状况的指示物种。然而，自20世纪60年代末以来，该物种在大多数欧洲国家呈现种群下降趋势，波兰亦受影响，部分地区当前种群密度已低于20世纪60至70年代的年度捕获水平。尽管如此，部分区域种群密度仍足以支持通过规范狩猎进行可持续的年度利用。

导致野兔种群急剧下降的原因是多方面的，包括农业集约化与植物保护产品的大规模使用、气候变化导致的栖息地丧失、捕食者压力以及多种病因的疾病。在疾病因素中，兔病毒属病毒（lagoviruses）对兔形目种群动态的影响尤为显著。20世纪80年代，欧洲野兔综合征（European brown hare syndrome, EBHS）首次在斯堪的纳维亚被诊断，随后迅速传播至欧洲多国，造成野兔种群急剧下降。该病由EBHS病毒（EBHSV, GII.1）引起，属于杯状病毒科（Caliciviridae）兔病毒属。与此同时，20世纪80年代在家兔中发现了由密切相关但不同的病毒——兔出血症病毒（RHDV, GI.1）引起的类似严重病毒性疾病。两种兔病毒属病毒在临床、病理和流行特征上具有诸多相似性，其结构和进化上的相似性通过交叉免疫应答得到证实。2010年，法国检测到新型兔出血症病毒RHDV2（GI.2），该病毒能导致已接种疫苗的家兔和一个月龄以下幼兔死亡，并能跨越物种屏障感染野兔，引起类似EBHS的疾病。

在波兰，EBHSV于1992年首次在野兔中检出，早期研究还首次确认了3%本土野兔存在抗RHDV抗体。然而，2020至2021年间覆盖波兰两个区域的研究在113只野兔中未检测到RHDV2。基于此，本研究旨在评估波兰部分种群密度足以支持可持续狩猎管理的区域中，野兔的种群指标及针对EBHSV和RHDV2抗体的存在情况，通过整合种群指标与血清学结果，为自由生活的野兔种群中兔病毒属病毒暴露情况提供信息。

二、研究设计与技术方法

本研究以2022/2023狩猎季节期间，从波兰东部5个区域采集的109只野兔为样本。样本来自符合波兰狩猎法规的死亡野兔，无需伦理委员会批准。研究人员使用便携式电子秤测量体重，采用基于体重和Stroh方法（依据前肢软骨肿胀存在与否）判定幼体（1岁以下）和成体（1岁以上），并根据第二性征判定性别。在野外直接从野兔体内采集血液样本用于分析。

种群指标方面，研究人员使用繁殖系数、繁殖指数/成功率、种群增长系数和种群增长量等参数描述种群增长动态。血清学检测方面，使用意大利IZSLER公司商业化的两种ELISA试剂盒分别检测EBHSV和RHDV2抗体，试剂盒包含阴性和阳性对照血清、病毒抗原及辣根过氧化物酶标记的特异性单克隆抗体，能够高灵敏度检测针对两种病毒的抗体。血清滴度定义为抑制阴性对照血清在492 nm吸光度50%的测试血清稀释度。统计分析方面，使用Shapiro–Wilk检验验证正态性、Levene检验评估方差齐性、t检验比较两组正态分布变量、Mann–Whitney U检验分析抗体滴度、Fisher精确检验和卡方检验分析血清阳性率与性别和年龄的关联、Kruskal–Wallis检验比较区域间差异，并使用广义混合效应协方差分析模型（Mixed ANCOVA）进行多因素评估，以区域为随机效应，性别、年龄和EBHSV血清状态为固定效应，体重为协变量。

三、研究结果

3.1 种群结构评估

幼体和成体野兔的体重在各区域间变异较小。雄性和雌性体重无显著差异（4.09 kg对4.11 kg，t = ?0.381，p = 0.704），但年龄组间差异显著（t = ?10.212，p < 0.001），成体平均体重（4.40 kg）比幼体（3.88 kg）重0.5 kg以上。总体而言，研究种群中雌性比例（56%）高于雄性（44%），幼体（57.8%）多于成体（42.2%）。然而，各区域内部年龄/性别构成偏离平均值，如区域III成体占100%，区域V幼体占95.7%。区域V的极端种群增长值反映了狩猎捕获组成偏差而非真实的生物学补充率。种群指标分析显示各区域参数变异显著，但所有区域种群增长系数均为正值，表明种群以中等速率增长。然而繁殖系数在大多数区域徘徊在1.0左右，提示种群进一步增长的潜力受限。鉴于部分区域样本量有限，这些发现需谨慎解读。

3.2 EBHSV血清阳性率

在109只来自5个地理区域的野兔中，EBHSV抗体总体血清阳性率为78.9%（95% CI: 70.1–86.1%）。86只血清阳性野兔的抗体滴度处于低（10–40）或中等（40–160）范围，23只（21.1%）未检出抗体。各批次中血清阳性比例介于72.3%至87.0%之间。按性别分析，雌性EBHSV血清阳性率为85.2%（52/61），雄性为70.8%（34/48），雌性略高但未达统计学显著水平（Fisher精确检验p = 0.097；卡方检验p = 0.067）。按年龄分析，幼体血清阳性率为81.0%（51/63），成体为76.1%（35/46），差异不显著（Fisher精确检验p = 0.482）。区域间血清阳性率无显著地理差异（卡方检验p = 0.580），抗体滴度亦无显著差异（Kruskal–Wallis检验p = 0.918）。值得注意的是，EBHSV血清阳性个体平均体重（4.15 kg）显著高于血清阴性个体（3.91 kg）（t = 2.875，p = 0.0049），反映了野兔生物学成熟度与病原体暴露持续时间之间的关系。混合效应模型分析显示，唯一对EBHSV抗体存在具有统计学显著影响的因素是体重（p = 0.0061），年龄（p = 0.1208）和区域随机效应（p = 0.2174）无显著影响，性别呈弱趋势（p = 0.0777）。

3.3 RHDV2血清阳性率

在109份血清样本中检测到11份存在RHDV2反应性抗体，平均血清阳性率为10.1%（95% CI: 5.2–17.3%）。ELISA滴度范围为20（7份）、40（1份）至80（3份）。11只RHDV2阳性野兔中有9只的EBHSV抗体滴度高于RHDV2滴度，提示两病毒间可能存在交叉反应。仅2只来自区域V（栋布罗瓦塔尔诺夫斯卡附近）的野兔RHDV2反应性抗体滴度（80）分别为EBHSV抗体滴度的8倍和4倍，其Rt值（RHDV2/EBHSV ELISA滴度比值）分别为8和4，可能提示既往暴露于RHDV2抗原。按性别分析，雌性RHDV2血清阳性率为11.5%（7/61），雄性为8.3%（4/48），差异不显著（Fisher精确检验p = 0.752）。按年龄分析亦无显著差异（Fisher精确检验p = 0.522）。区域间无显著差异（卡方检验p = 0.394）。RHDV2血清阳性与阴性个体间体重无显著差异（t = 0.091，p = 0.927）。混合效应模型分析显示，唯一对RHDV2反应性抗体存在具有统计学显著预测作用的因素是EBHSV血清状态（p = 0.0366），即具有EBHSV抗体的野兔RHDV2反应性抗体阳性率显著更高。鉴于EBHSV是种群中的优势血清型（78.9%），RHDV2血清阳性个体几乎全部来自已具有EBHSV抗体的群体，这一相关性强烈支持两病毒抗原间存在交叉反应的假说，或提示传播途径和共同环境媒介的重叠。

四、讨论与结论

讨论部分指出，波兰野兔种群的急剧下降自20世纪70年代以来长期存在，且在当前生态和种群状况下持续恶化，这反映了整个欧洲更广泛的现象。EBHS病毒自20世纪80年代以来对野兔种群下降有显著贡献，在波兰尤其自20世纪90年代中期以来影响显著。本研究种群指标结果证实了先前研究结论，即体重仅由年龄决定，区域作用较小。尽管种群增长率为正，但相对较低的繁殖系数提示种群补偿额外死亡率的能力受限。RHDV2作为对野兔种群的潜在威胁，其能够克服物种屏障偶尔感染野兔。尽管波兰本土野兔种群中尚未确认RHDV2感染，但传统户外养殖系统中家兔作为潜在暴露源的作用值得进一步研究。本研究中EBHSV高血清阳性率（78.9%）与先前波兰研究和意大利近期报告一致，表明所检野兔中EBHSV既往暴露广泛。RHDV2反应性抗体在11只野兔中检出（10%），其中9只EBHSV滴度高于RHDV2滴度，提示交叉反应不能排除；仅2只来自区域V的野兔RHDV2滴度显著高于EBHSV滴度，该区域2018至2020年间曾多次检出GI.3/GI.2基因群RHDV2毒株，且2025年有未发表数据进一步确认，加之斯洛伐克东部近期首次检出RHDV2引起的兔出血症疫情，为RHDV2血清反应性提供了流行病学背景。然而，RHDV2血清学结果需谨慎解读，因交叉反应的可能性无法排除，需通过分子检测方法进行确认。

结论部分指出，来自波兰5个区域的野兔种群指标分析显示各区域体重相近，但幼体和成体间差异显著。种群增长指数为正，但相对较低的繁殖指数提示所研究种群的繁殖潜力有限。血清学分析证实了全部5个种群密度稳定区域中EBHSV特异性抗体的存在，总体血清阳性率为78.9%，表明所检野兔中该病毒暴露广泛。10.1%的动物中检测到RHDV2反应性抗体，为自由生活的野兔中RHDV2血清学反应性提供了证据。鉴于抗原相关兔病毒属病毒间交叉反应的可能性，RHDV2血清学结果应谨慎解读并需分子方法验证。将种群指标评估与血清学数据相结合，能够更全面地表征所研究野兔种群的种群结构、繁殖指标和兔病毒属病毒暴露的血清学证据。研究结果支持未来将种群评估与血清学监测、分子诊断和兔病毒属病毒基因组表征相结合的综合监测的价值，有助于阐明EBHSV和RHDV2的流行病学意义，并增进对自由生活野兔种群中兔病毒属病毒-宿主互作的理解。