利用Prime Editing技术在Xa23启动子中插入多个效应子结合元件赋予水稻对白叶枯病的抗性

《Agronomy》：Engineering Bacterial Blight Resistance in Rice by PE-Mediated Insertion of Multiple EBEs into the Xa23 Promoter

　　

由黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo）引起的白叶枯病是严重降低水稻产量的最严重细菌病害。先前研究表明，将效应子结合元件（effector binding elements, EBEs）插入到Xa23启动子中，可使模式籼稻品种（O. sativa japonica）获得对多种Xoo的抗性。因此，有必要对优良品种进行编辑，以验证该策略在水稻生产中的可行性。在本研究中，研究人员采用引导编辑（prime editing, PE）技术，在优良品种绥粳18的抗病基因Xa23启动子区域高效敲入了四个连续的EBE序列。研究人员构建了PE载体并将其转化至水稻愈伤组织，鉴定出了无转基因纯合编辑植株。生物测定结果显示，与野生型对照相比，编辑后的植株对两种Xoo菌株（PXO86和PXO99A）表现出显著更高水平的抗性。本研究表明，Grand PE技术能够高效地将白叶枯病抗性引入优良品种。

论文解读：利用Prime Editing技术向Xa23启动子插入多个效应子结合元件创制水稻白叶枯病抗性

一、研究背景与科学问题

由黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo）引起的水稻白叶枯病是亚洲和非洲最严重的水稻细菌病害之一，严重时可导致产量损失达30%。病原菌主要通过水孔或伤口进入叶片内部，释放转录激活样效应子（transcription activator-like effectors, TALEs），靶向感病基因（S基因）启动子区域的效应子结合元件（effector binding elements, EBEs），从而激活S基因的表达，导致叶片细胞死亡。在中国，华南、华中和华东地区的水稻生产受该病害影响严重，而东北和西南地区相对较轻。不同地区的致病菌生理小种存在差异，南方籼稻区以Ⅸ型和Ⅴ型为主，北方粳稻区则以Ⅰ型和Ⅱ型为主。

目前，化学药剂如噻唑锌和噻菌铜被广泛用作有效杀菌剂，但大规模使用不仅增加成本，还存在筛选出耐药病原菌的风险。因此，迫切需要创制具有广谱抗性的水稻品种。基因组编辑技术为此提供了高效工具。已有研究通过CRISPR/Cas9技术敲除感病基因启动子区的EBE序列获得了抗性，此外，利用TALE的基因激活功能激活抗病基因也可实现抗性。

在水稻中，Xa23编码一个含有113个氨基酸、具有预测跨膜结构域的executor R蛋白，可通过触发局部超敏反应阻止病原菌扩散。其表达受Xoo分泌的TALE AvrXa23特异性诱导，该效应子可结合启动子中的特定EBE。因此，携带EBE的Xa23基因能使水稻对含有相应TALE的Xoo菌株产生抗性。此前有研究通过粒子轰击法将单个EBE序列插入Xa23启动子实现了抗性，但由于自然Xoo群体中TALE库的高度多样性，插入单个EBE难以提供持久的广谱抗性。为解决这一问题，插入多个EBE序列是一种可行策略。然而，此前采用粒子轰击法的效率较低，且受体为研究用模式品种，该策略在商业品种中是否适用仍需进一步探究。

二、研究目的与研究结论

本研究旨在利用引导编辑（prime editing, PE）技术，特别是Grand PE策略，在优良品种绥粳18的抗病基因Xa23启动子区域精确插入四个保守的EBE序列（Tal10–15、Tal15–45、TalS1、TalS2），从而赋予水稻对白叶枯病的广谱抗性。研究结果表明，Grand PE技术能够高效地在优良品种中实现目标片段的精准插入，编辑后的植株对两种Xoo菌株（PXO86和PXO99A）均表现出显著增强的抗性，证明了该策略的有效性。

三、关键技术方法概述

研究人员采用了以下关键技术方法开展研究：（1）Grand PE载体构建：设计包含两个pegRNA序列（含间隔序列、引物结合位点PBS和逆转录模板RTT）的DNA片段，组装至PE模板载体pG3H-Csy4PE6c.2中；（2）原生质体制备与瞬时转染：将优良品种绥粳18的种子无菌萌发后分离原生质体，导入PE质粒进行瞬时编辑验证；（3）农杆菌介导的水稻遗传转化：将质粒转入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404，用于转化绥粳18的水稻愈伤组织；（4）分子鉴定：对T₀代植株提取基因组DNA，利用特异性引物进行PCR扩增确认EBE整合；（5）Xoo接种与病斑评价：使用Xoo菌株PXO86和PXO99A，采用剪叶法接种8周龄水稻植株，14天后测量病斑长度；（6）qRT-PCR分析：在接种后0、6、18小时采集叶片组织，检测编辑基因的时序表达。

四、研究结果

3.1 载体构建与瞬时编辑验证

研究人员按设计将编辑引入Xa23启动子区域，构建了Grand PE载体。为检验该载体在水稻细胞中的工作效果，进行了水稻原生质体瞬时编辑实验。从转染细胞中提取DNA，设计特异性引物扩增插入事件，测序结果显示左、右边界连接处的序列均正确，证明PE载体能够在精确位置以精确序列插入目标片段。

3.2 稳定转化与编辑植株鉴定

将PE载体转入农杆菌后转化绥粳18水稻愈伤组织，经潮霉素筛选获得两株T₀代转基因水稻植株。PCR检测发现其中一株在Xa23启动子区发生了EBE插入。详细测序数据显示，实际编辑产物比设计长19 bp，这19 bp为右侧连接处的水稻基因组片段。幸运的是，该编辑产物完整包含了四个EBE序列，因此预期生物学功能得以保留。同时，对每个pegRNA预测的前五个脱靶位点进行扩增测序，结果显示编辑植株与野生型之间无差异，表明该PE方法的脱靶风险很低。

3.3 编辑等位基因的遗传稳定性

收获编辑植株的T₁代种子，检测后代中转基因和编辑等位基因的存在情况。基因分型结果显示，转基因阳性植株与阴性植株的比例符合孟德尔遗传定律预测的3:1分离比，编辑等位基因也呈现类似的分离模式。最终获得了15株无转基因纯合编辑植株。

3.4 抗病表型评价

使用Xoo菌株PXO86和PXO99A对无转基因T₂代纯合编辑幼苗和野生型对照进行接种试验。接种14天后测量病斑长度，结果显示：对于PXO86菌株，野生型植株平均病斑长度为7.11 cm，而编辑植株仅为1.82 cm；对于PXO99A菌株，编辑植株同样表现出显著增强的抗性。进一步比较杂合与纯合编辑植株的抗性水平，发现两者对两种菌株的抗性程度相似，证实编辑等位基因理论上应作为显性抗病性状发挥作用，这一特性有利于在杂交水稻制种中的应用（只需编辑一个亲本）。

3.5 基因表达分析

qRT-PCR分析显示，接种Xoo菌株PXO99A和PXO86后，编辑植株中Xa23的转录水平在接种后6小时即显著上调，相对于野生型对照提高了40倍以上，这一表达模式很好地支持了编辑植株所表现出的增强抗性。

五、讨论与结论

讨论总结

本研究不同于以往通过敲除S基因或其启动子区EBE来削弱感病性的策略，而是采用“反向”设计，将EBE插入R基因Xa23的启动子区，“劫持”病原菌的TALE效应子来激活R基因介导的免疫防御。研究所使用的多个EBE序列已被前期研究确认为多种Xoo菌株中TALE的保守靶标，因此在优良品种Xa23启动子中插入这些EBE应能赋予对更多Xoo菌株的抗性。

本研究存在以下局限性：第一，抗病表型仅来自单个编辑事件，尽管编辑等位基因正常分离且抗性稳定遗传，但体细胞无性系变异不能完全排除；此外，该编辑事件在四个EBE之外还多出了19 bp插入，虽然qRT-PCR数据表明含19 bp插入的编辑启动子在接种后可被有效激活，但19 bp插入单独是否影响基础及诱导启动子活性尚需澄清，理想情况下应获得不含19 bp重复的完美编辑启动子；第二，生物测定仅限于两种Xoo菌株，未评估更广泛地理菌株或田间条件下的抗性谱和稳定性；第三，虽未观察到编辑植株与野生型在株高和结实率上的明显差异，但仍需开展详细研究以考察编辑植株在田间条件下是否具有相同或更好的农艺表现。

与此同时，研究人员使用了Grand PE而非粒子轰击法，为将该性状引入其他优良品种提供了更高效的工具体系。遵循类似思路，另一种向植物细胞递送TALE的严重水稻细菌病原体——水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzicola），也可通过将相应EBE插入Xa23或其他合适R基因来进行有效防控。因此，PE介导的R基因多EBE插入策略为创制水稻多种病害抗性性状提供了有效途径。

研究结论翻译

本研究表明，Grand PE策略能够高效介导多个效应子结合元件（EBEs）插入Xa23启动子，编辑后的植株表现出对水稻白叶枯病增强的抗性。后续应开展进一步研究，以验证编辑植株在田间条件下的抗病谱和农艺表现。