HEPLISAV-B通过CD4 T细胞/CD40L依赖机制打破慢性乙型肝炎免疫耐受并实现HBV控制

《Vaccines》：HEPLISAV-B Breaks Immune Tolerance and Induces HBV Control via CD4 T Cell-Dependent Mechanism in Chronic HBV Mouse Model

　　

背景：慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染（CHB）影响全球近3亿人，目前抗病毒治疗仍不可治愈，这些治疗可抑制病毒复制但很少实现功能性治愈，功能性治愈定义为乙型肝炎表面抗原（HBsAg）持续丢失。CHB以病毒诱导的深度免疫耐受为特征，限制了常规治疗性疫苗接种策略的疗效。目的：评估HEPLISAV-B（一种CpG-1018佐剂的HBsAg疫苗）在CHB小鼠模型中打破免疫耐受并诱导功能性治愈样应答的治疗疗效和免疫机制。设计：使用腺相关病毒-HBV（AAV-HBV）小鼠模型，对具有高水平持续性HBV病毒血症的小鼠接种两剂HEPLISAV-B。评估血液和肝脏中的病毒学结局、免疫应答和机制。结果：HEPLISAV-B诱导快速且持久的HBsAg清除，显著降低循环和肝内HBV DNA和RNA，并抑制病毒复制且无肝细胞损伤。疫苗接种引发强健、持续的抗-HBs IgG1和IgA应答，增强HBsAg特异性T细胞和B细胞免疫，减少CD4调节性T细胞，并降低CD4 T细胞上的PD-1表达。治疗疗效严格依赖CD4 T细胞和CD40/CD40L信号通路，但不依赖CD8 T细胞，表明CD4驱动的非细胞溶解性抗病毒机制对HEPLISAV-B诱导的HBV控制至关重要。结论：HEPLISAV-B有效打破HBV诱导的免疫耐受，并通过CD4 T细胞/CD40L依赖途径恢复协调的抗病毒免疫。研究结果支持其作为CHB患者治疗性疫苗的潜力。

慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染（CHB）仍是全球重要健康问题，可导致肝硬化及肝细胞癌。现有核苷（酸）类似物治疗虽能抑制病毒复制，但很少实现HBsAg和HBV DNA持续丢失的功能性治愈。已恢复急性HBV感染个体通常具有强健的抗体、CD4及CD8 T细胞应答，而慢性感染者不能产生有效抗-HBs抗体，HBV特异性CD4和CD8 T细胞功能失调，形成以高病毒载量和轻微肝脏炎症为特征的HBV特异性免疫耐受。高浓度系统病毒抗原可损害树突状细胞、自然杀伤细胞及T、B细胞功能，促进HBV持续。因此，克服免疫耐受、激发有效抗HBV免疫应答是治疗性疫苗开发的主要挑战。研究人员此前发现CpG-1826佐剂疫苗可在AAV-HBV模型中打破耐受并清除病毒，但短期效应为主，长期耐久性、病毒反弹及不良反应未充分探讨，且对高病毒血症小鼠无效。CpG-1018是HEPLISAV-B所用佐剂，HEPLISAV-B为FDA批准的新型疫苗，在常规疫苗应答不佳人群中具有优势。该研究因此评估HEPLISAV-B在慢性HBV小鼠模型中的治疗疗效及机制，以明确其打破免疫耐受、实现病毒控制的潜力及免疫学基础。

关键技术方法：研究采用雄性C57BL/6小鼠经静脉注射AAV-HBV（5×10¹⁰ gc/只）建立慢性HBV携带模型，在感染后4和8周肌内接种两剂HEPLISAV-B并进行剂量递增；通过qPCR/RT-qPCR、ELISA、免疫印迹、免疫荧光、H&E和TUNEL、流式细胞术及ELISPOT评估病毒学、肝脏病理和免疫应答；利用抗CD4、抗CD8和抗CD40L抗体进行体内清除或阻断实验。样本来源为上述小鼠模型，无人类队列。

研究结果：
3.1 HEPLISAV-B打破耐受并抑制慢性HBV携带小鼠的HBV产生：研究人员在AAV-HBV慢性携带小鼠中于4和8周接种HEPLISAV-B，以qPCR、ELISA、免疫印迹和免疫荧光检测病毒学指标；结果显示，常规佐剂未诱导血清学转换或降低病毒血症，而HEPLISAV-B使血浆HBV DNA下降约1000倍并维持至24周（16周有部分反弹），HBeAg显著下降，HBsAg变为不可测，血浆及肝内HBsAg、HBcAg明显减少，肝内HBV总RNA、3.5 kb RNA、总HBV DNA及AAV-HBV ITR DNA均下降，ALT未升高，提示非细胞溶解性病毒控制。
3.2 HEPLISAV-B在慢性HBV携带小鼠中诱导强健抗-HBs IgG1和IgA应答：通过ELISA检测发现，HEPLISAV-B在HBV感染小鼠中诱导升高且持续的抗-HBs IgG，≥10⁴ U/mL并持续16周以上，与HBV未感染接种小鼠相当；HBsAg特异性IgG1和IgA显著升高，提示Th2偏向的S特异性应答及可能的黏膜免疫。通过PMA/ionomycin刺激和HBsAg特异性ELISPOT，发现接种小鼠CD4和CD8 T细胞产生IFN-γ和TNF-α增强，HBsAg特异性IFN-γ⁺斑点及HBsAg特异性IgG斑点数和平均斑点大小增加，提示HEPLISAV-B克服HBsAg免疫耐受并恢复T、B细胞应答。
3.3 HEPLISAV-B治疗疗效需要CD4 T细胞而不需要CD8 T细胞：通过肝脾免疫分析及抗CD4/抗CD8抗体清除实验，发现接种小鼠肝内免疫浸润增加但TUNEL阳性细胞和ALT未增加，肝内IFN-I、ISGs、促炎细胞因子/趋化因子及PD-1/PDL-1转录未见显著改变，LY6D、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-21下降而IL-27、CXCL-11升高；脾脏CD45细胞、B细胞增加，NK细胞减少，Treg（CD25⁺FOXP3⁺及CD25^?FOXP3⁺）和CD4 T细胞PD-1表达下降，CD8 T细胞PD-1不变，CD4 TCM、CD8 TEM及TCM/TEM CD4比值增加。CD4清除消除HEPLISAV-B诱导的HBV DNA下降、HBsAg清除、抗-HBs诱导及肝内HBV RNA/DNA/AAV DNA和HBsAg/HBcAg下降；CD8清除不影响疗效并提高抗-HBs IgG，提示疗效依赖CD4 T细胞，CD8 T细胞非必需。
3.4 HEPLISAV-B治疗疗效依赖CD40/CD40L信号：通过抗CD40L阻断抗体联合HEPLISAV-B处理，发现阻断CD40/CD40L信号完全取消HEPLISAV-B诱导的HBsAg清除、抗-HBs产生及肝内HBsAg和HBcAg下降，表明CD40/CD40L通路对HEPLISAV-B介导的抗病毒免疫至关重要。

讨论部分总结：该研究显示，HEPLISAV-B可克服HBV相关免疫功能障碍，在高病毒血症AAV-HBV模型中诱导HBsAg清除，并优于铝佐剂及Montanide/IL-12佐剂HBV疫苗，突出佐剂选择对治疗性疫苗的重要性。病毒学控制伴随肝内HBV转录本和DNA显著下降，且无肝细胞损伤证据；肝内AAV-HBV ITR阳性附加体DNA亦明显下降，提示通过非细胞溶解过程减少HBV产生模板。HEPLISAV-B诱导强健持久抗-HBs应答，IgG1和IgA富集，并增强IFN-γ、TNF-α产生及HBsAg特异性T细胞应答，降低Treg和CD4 T细胞PD-1表达，增加记忆亚群，提示协调恢复体液和细胞免疫。机制上，CD4 T细胞清除消除疗效，CD8 T细胞清除不损害疗效并提高抗-HBs；CD40L阻断完全消除疗效，支持CD4 T细胞/CD40L–CD40/B细胞轴。讨论同时指出局限：AAV-HBV模型不能重现真实HBV cccDNA持续存在，附加体DNA下降不能等同于cccDNA清除；残余循环HBV DNA来源未明；TLR9表达存在种属差异；缺乏CpG-1018单药组；长期耐久性和重复固有免疫刺激的安全性仍需研究。

研究结论翻译：该研究证明，治疗性接种HEPLISAV-B——一种以Toll样受体9（TLR9）激动剂CpG-1018为佐剂的已获批乙型肝炎表面抗原疫苗——可克服已建立的免疫耐受，并在慢性高水平HBV病毒血症小鼠中诱导功能性治愈样病毒学控制。两剂疫苗诱导快速且持久的HBsAg清除，显著降低循环和肝内HBV DNA和RNA，并减少肝内病毒复制及附加体AAV-HBV DNA，且无明显肝细胞损伤。这些效应伴随持续抗-HBs IgG1和IgA应答、增强的HBV特异性T细胞和B细胞免疫、降低的Treg频率以及CD4 T细胞上PD-1表达下降，表明抗病毒体液和细胞免疫得到协调恢复。机制上，疫苗疗效依赖CD4 T细胞和CD40–CD40L信号，但不依赖CD8 T细胞，识别出CD4驱动的非细胞溶解性HBV控制通路。尽管AAV-HBV模型不能重现真实HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）持续存在，且HBsAg和CpG-1018各自贡献尚待明确，这些发现为评估HEPLISAV-B作为CHB治疗性疫苗提供了强机制依据。CD4 T细胞辅助和CD40–CD40L信号成为关键机制及未来研究的潜在免疫相关指标。需在临床相关模型和临床试验中进一步评估，包括与核苷（酸）类似物和其他免疫调节剂的联合策略，以确定该策略能否转化为患者功能性治愈。