钙离子反胶束角鲨烯乳液（CISE）新型疫苗佐剂递送系统的构建与免疫效应研究

《Vaccines》：Calcium-Containing Squalene Emulsion as a Novel Vaccine Adjuvant Delivery System

　　

目的：利用钙离子对磷酸基团和生物大分子的高亲和力，构建一种新型基于钙离子的角鲨烯油包水乳液——钙离子反胶束角鲨烯乳液（CISE），作为疫苗佐剂递送系统。方法：采用超声乳化法制备CISE，并通过激光粒度分析和透射电子显微镜（TEM）进行表征。通过体外和体内实验评价其佐剂效能和生物相容性。结果：CISE粒径约为124.7 nm，具有良好的分散性。体外实验表明，抗原提呈细胞（APCs）主要通过小窝蛋白介导的内吞作用高效摄取CISE。CISE促进骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的成熟和活化，伴随活性氧（ROS）产生增加和过氧化物酶体活性增强。值得注意的是，CISE在APCs内具有显著的溶酶体逃逸能力。在小鼠中进行两轮皮下免疫后，CISE诱导高水平的IgG抗体并引发相对平衡的Th1/Th2免疫应答。经肺部黏膜免疫后，CISE不仅触发强效的IgG产生，还诱导高水平的IgA抗体。结论：当负载模型抗原时，CISE有效诱导体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫，显示出作为疫苗佐剂的巨大潜力。

论文解读：钙离子角鲨烯乳液佐剂递送系统协同激活体液、细胞与黏膜免疫

研究背景与现存问题：传染病长期严重威胁人类健康，病原体突变、耐药性上升和全球人口流动加剧使疾病防控更加复杂。传统疫苗中，减毒活疫苗存在残余毒力风险；灭活疫苗和亚单位疫苗免疫原性较低，需借助佐剂增强免疫应答。铝佐剂应用最广，但诱导Th1型细胞免疫能力有限，且可能引起局部炎症和IgE升高风险；MF59虽已用于临床季节性流感疫苗，但无法在病原入侵的黏膜门户建立有效免疫防御；磷酸钙佐剂生物相容性好，但免疫刺激效力需进一步提高。因此，构建能同时激活体液、细胞和黏膜免疫的新型佐剂递送系统具有重要意义。

研究内容与结论：研究人员利用钙离子对磷酸基团和生物大分子的高亲和力，以角鲨烯为油相、大豆磷脂酰胆碱（SPC）和氯化钙为功能组分，构建了钙离子反胶束角鲨烯乳液（CISE）。透射电镜观察到的油滴内暗点证实Ca²⁺与SPC形成反胶束并定位于胶束水核内。体内外实验表明，CISE可被抗原提呈细胞（APCs）高效摄取，促进树突状细胞成熟，诱导溶酶体逃逸、活性氧（ROS）产生及过氧化物酶体活性增强；免疫小鼠后诱导高水平IgG抗体、相对平衡的Th1/Th2应答，经肺部黏膜免疫还可在多个黏膜部位诱导sIgA抗体，显示出作为疫苗佐剂的显著潜力。

关键技术与方法：CISE经超声乳化法制备，采用激光粒度分析仪和透射电子显微镜（TEM）表征理化性质。以卵清蛋白（OVA）为模型抗原。体外实验使用RAW264.7细胞及小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs）；动物实验采用6–8周龄雌性昆明（KM）小鼠（购自安徽医科大学实验动物中心），通过皮下免疫和气管内滴注两种途径给药。主要检测手段包括流式细胞术、激光扫描共聚焦显微镜、MTT法、ELISA及H&E组织病理学检查。

结果：

CISE特性：CISE平均粒径为124.7±0.6 nm，多分散系数（PDI）为0.205±0.03，zeta电位为?9.3±0.73 mV。TEM显示乳液液滴呈100–200 nm浅色圆形区域，内部暗点验证钙-磷脂反胶束的存在。7天稳定性测试中粒径和zeta电位基本不变，表明制剂具有短期储存稳定性。

体外CISE对APC无毒性且通过多种途径被高效摄取：MTT结果显示，角鲨烯浓度高达1200 μg/mL时细胞活力仍保持在80%以上。流式和共聚焦结果显示，CISE在RAW264.7细胞和BMDCs中的摄取效率均高于角鲨烯水包油乳液（SWE）和磷酸钙（CaP）对照佐剂。经内吞抑制剂预处理后，甲基-β-环糊精（MCD）处理显著降低两种细胞的平均荧光强度，而氯丙嗪（CPZ）、阿米洛利（AMI）和4°C处理无显著影响，表明CISE主要通过小窝蛋白介导的内吞途径进入细胞。

CISE促进BMDCs共刺激分子表达并诱导RAW264.7细胞溶酶体逃逸：OVA-CISE处理BMDCs后，CD40、CD80和CD86表达显著上调。共定位分析显示，CISE在4 h和8 h时与溶酶体高度共定位，16 h时出现明显分离，Cou6-CISE和Cal-CISE与溶酶体的Pearson系数分别为0.89和0.78，证实CISE具备溶酶体逃逸能力。

CISE诱导APCs产生活性氧并增强过氧化物酶体活性：流式结果显示CISE组ROS水平显著高于对照组，同时过氧化物酶体平均荧光强度也显著升高；共聚焦图像进一步证实CISE组过氧化物酶体红色荧光强度明显高于其他组，提示ROS产生处于可控范围。

CISE诱导强效体液和细胞因子应答：两次免疫后，OVA-CISE在小鼠中诱导了高水平的OVA特异性IgG抗体，IgG2a/IgG1比值约为1，呈相对平衡的Th1/Th2应答。肺部黏膜免疫后，多个黏膜部位灌洗液中的sIgA水平显著升高，而皮下注射对照组sIgA几乎无法检出。OVA刺激的脾细胞上清中，CISE组白细胞介素-4（IL-4）和干扰素-γ（IFN-γ）水平显著高于对照组，表明CISE可同时增强体液和细胞免疫。

CISE体内安全性评价显示OVA-CISE诱导高增殖性免疫细胞和T细胞应答：MTT法显示CISE组脾细胞增殖刺激指数显著高于对照组；流式分析显示CISE组CD4⁺ T细胞比例高于SWE和CaP组。免疫后小鼠体重无明显变化，心、肝、脾、肺、肾组织的H&E染色未见明显病理学异常。

讨论与结论：讨论部分指出，钙离子在细胞内逐渐解离释放，可持续调节抗原加工和交叉提呈；角鲨烯乳液可快速募集APCs并建立促炎微环境，二者的合理组合实现了协同增强的免疫刺激效果。CISE可通过小窝蛋白介导内吞、溶酶体逃逸、ROS产生等机制促进APC成熟活化；IFN-γ和IL-4水平升高与IgG亚类结果共同支持混合型Th1/Th2应答的诱导。肺部给药可能通过激活支气管相关淋巴组织（BALT）并经共同黏膜归巢机制实现多部位黏膜免疫。研究局限性包括：未直接分析呼吸道黏膜组织驻留免疫细胞表型与功能；未区分中枢记忆T细胞（T_CM）与效应记忆T细胞（T_EM）；未在病原体攻毒模型中验证保护效力。结论：本研究成功构建了钙离子包载角鲨烯乳液佐剂（CISE），该制剂具有良好的物理储存稳定性和低体内毒性，可同时激活体液、细胞和黏膜免疫应答，对呼吸道传染病黏膜疫苗研发具有重要参考价值，经深入机制研究和攻毒实验评估后有望成为黏膜疫苗候选佐剂。