《Cell Reports》：RAStoERK: A reference interaction atlas for insights into signaling and disease
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RAS/RAF/MEK/ERK通路因其在生理与疾病中的作用已被广泛研究，但仍缺乏对其与更广泛细胞环境相互作用的系统层面认识，限制了对旁系同源特异性作用、突变驱动重构和跨通路整合的理解。为解决这一问题，研究人员同时绘制了该通路所有组分及其激活型和失活型突变的相互
RAS/RAF/MEK/ERK通路因其在生理与疾病中的作用已被广泛研究，但仍缺乏对其与更广泛细胞环境相互作用的系统层面认识，限制了对旁系同源特异性作用、突变驱动重构和跨通路整合的理解。为解决这一问题，研究人员同时绘制了该通路所有组分及其激活型和失活型突变的相互作用组（interactome），鉴定出2,500个高置信相互作用蛋白，其中88%此前未报道，并生成了该通路在静息和激活状态下的高置信、综合性参考图谱。该通路表现得像一个“分子有机体”，与其他信号复合物（signaling complex）相连，从不同亚细胞位点发挥作用，并整合入与生理和疾病相关的网络。数据集探索揭示了旁系同源和突变特异性相互作用特征以及通路水平串扰（crosstalk），包括与mRNA代谢和WNT信号传导此前未知的联系。RAStoERK.univie.ac.at提供的相互作用组为无偏发现、靶向机制研究和潜在治疗探索提供了基础性社区资源。
一、研究背景与问题
RAS/RAF/MEK/ERK通路（RAS/RAF/MEK/ERK pathway，经典MAPK信号级联）参与基本细胞过程及多种人类疾病。RAS体细胞突变是强效人类癌基因事件，见于20%以上癌症，且预后较差；RAS长期被视为难以成药，尽管等位基因特异性抑制剂或降解剂等策略出现，但通路再激活或平行通路激活等耐药机制限制了疗效。RAF/MEK/ERK激酶级联位于RAS下游，RAF也在癌症中突变但频率不同，旁系同源物具有不同必需功能，部分依赖蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）及与其他通路串扰而非仅酶活性。既有研究缺乏对通路组分所形成相互作用及其被失活/激活突变扰动的全面认识，而不同实验室产生的相互作用图谱重叠有限，整合不同来源数据集不可靠。因此，研究人员采用单实验室、单通路策略， simultaneous绘制通路在天然及扰动状态的PPI网络，以预测降解剂和联合治疗效应并揭示通路串扰。
二、研究设计与总体结论
研究人员以同一亲本HEK293细胞系构建Dox诱导稳定细胞系，表达V5标签BirA*（TurboID）融合的35个bait（涵盖野生型、组成性失活（constitutively inactive，CI）和组成性激活（constitutively active，CA）状态），并将表达滴度调至接近内源水平；结合亲和纯化-质谱（affinity purification-mass spectrometry，AP-MS）与TurboID-质谱（TurboID-mass spectrometry，TbID-MS）及数据非依赖采集并行累积串联碎裂质谱（diaPASEF-MS）定量。研究鉴定出2,500余个高置信候选PPI（high-confidence candidate PPI，HCPPI），88%未见于IntAct数据库，生成迄今最全面的RAS至ERK通路相互作用参考图谱；AP-MS与TbID-MS高度互补，重叠约16%。激活增加每个bait的HCPPI数量及通路层级间互作组趋同，ERK例外。该资源为发现通路串扰、疾病联系和可干预机制提供基础。
三、关键技术方法（≤250字）
研究使用Flp-In T-REx HEK293细胞系，非临床样本队列；构建Dox诱导的V5-BirA*（TurboID）融合bait稳定细胞系，覆盖通路核心蛋白的WT、CI和CA状态。核心技术为AP-MS与TbID-MS并行，结合diaPASEF-MS深度定量；以GFP对照和层级特异性log2FC阈值过滤HCPPI，并进行GO/CRAPome背景过滤。验证手段包括V5/链霉亲和素pull-down、免疫印迹、RT-qPCR、TOPflash报告基因和免疫荧光。生物信息学整合IntAct、SIGNOR、CORUM、hu.MAP3.0、STRING、organelleIP、DisGeNET及癌症基因普查（Cancer Gene Census，CGC）等资源。
四、主要研究结果
1. 构建从RAS到ERK通路的综合相互作用图谱：通过Dox诱导稳定细胞系、表达滴定和AP-MS/TbID-MS互补检测，研究人员获得超过2,500个HCPPI，88%未在IntAct收录，RAF和MEK bait的互作组最大且新互作比例最高。结论是该图谱覆盖度和发现潜力显著超过既往高通量研究。
2. 质量控制与通路结构的初步认识：主成分分析和层次聚类显示三重复紧密聚类，互作组主要按通路四层聚集，RAS与ERK层远离RAF/MEK层，KRAS与H/NRAS分离；RAF与MEK重叠最大，CA-BRAF在AP-MS中接近MEK互作组。结论是数据变异低并初步揭示通路层级结构。
3. 基准评估、覆盖度与发现：与已知PPI比较，WT网络重现RAS同层、MEK1-MEK2、ERK1-ERK2及跨层连接；CA增加连接并重现RAF激活依赖异二聚，CI减少跨层连接。ERK互作组较小但已知互作比例高，捕获IntAct中37%的ERK互作及28个SIGNOR因果互作。结论是该策略确认并扩展了已知通路连接。
4. 状态特异性相互作用组重塑：CI/CA改变HCPPI在层级和旁系同源物间的分布；WT-RAF/RAS捕获最多，CA-MEK增益最大，ERK在WT最高而突变降低。CA除ERK外普遍扩大互作组，上层次激活趋同、下层次分化；CA增加跨层重叠并获RAS、RTK、PI3K信号互作，ARAF/RAF1突变体与14-3-3互作丢失。结论是激活增加互作潜力及通路层级趋同。
5. 与其他信号模块的广泛通路水平相互作用：将互作组映射至激酶树和磷酸酶树，发现约19.5%激酶和约20%磷酸酶，确认KSR、COT、PAK、RSK等并发现CLK、AURKA、PLK1、BUB1、BUBR1、CDC25C及DUSP6/7等。hu.MAP3.0、CORUM和SIGNOR分析显示与PI3K、cAMP/PKA、PP6等复合物状态依赖互作。结论是通路组分协调接合其他信号复合物。
6. 亚细胞、状态特异性的功能网络互作景观：利用organelleIP UMAP显示CI/WT互作组共定位，CA发生层级和旁系特异性亚细胞重分布，如KRAS偏向ER、HRAS偏向质膜/actin、ERK偏向核。按亚细胞分层富集到axon guidance、膜运输、N-糖基化和细胞周期等更特异过程，CA扩展外围机器。结论是互作组具有旁系分辨率和功能相关性。
7. 疾病相关相互作用图谱：以DisGeNET定义高置信疾病相关蛋白（high-confidence disease-associated protein，HCDP），CA互作组中HCDP增加，MEK2最明显；HCDP在RAF/MEK层交集富集，涉及通路遗传异常、癌症、HIV感染及炎症等。CA互作组与CGC交集形成79个HCPPI、180条互作的网络，65%此前未描述。结论是通路激活与遗传及获得性疾病网络广泛连接。
8. 旁系同源与突变特异性相互作用蛋白的同时检测揭示NRAS
Q61R对AKT激活的独特影响：NRAS
Q61R偏好PI3K亚基，并富集IRS2、AKT3和DEPTOR；NRAS
Q61R细胞呈现高AKT pT308、低pS473特征，而NRAS
Q61K或HRAS
Q61R未见。结论是NRAS
Q61R通过DEPTOR-mTORC2-mTORC1反馈塑造独特AKT磷酸化签名，并与PIK3CA相关过度生长谱疾病（PIK3CA-related overgrowth spectrum，PROS）相关蛋白相连。
9. 与mRNA代谢和WNT信号的串扰：TTP为CA-BRAF、RAF1、MEK1和MEK2的显著HCPPI，报告基因和RT-qPCR显示CA-RAF/CA-MEK降低TTP活性并致其靶mRNA积累。WNT相关互作组中β-CATENIN非依赖WNT信号富集最高，LRP5/6与WT/CA-RAF1互作，CA-RAF1促进TCF/LEF报告基因，ARAF和RAF1而非BRAF贡献WNT诱导报告基因及活性β-CATENIN积累。结论是通路与mRNA代谢及WNT信号存在功能串扰。
五、讨论与结论
讨论指出，AP-MS捕获稳定复合物、TbID-MS检测瞬时/邻近互作，两者互补形成迄今最大的ERK通路HCPPI资源；激活增加HCPPI数量及互作组趋同，网络呈共享核心与动态外周节点，支持信号串扰和时空协调是通路水平现象。CA突变HCDP多集中于RAF/MEK交集，并形成癌症相关核心网络。局限包括：全部实验在HEK293细胞中进行，不能完全复现体内生理；诱导多克隆表达和标签可能产生非生理互作或区室溢出；AP-MS和TbID-MS各有方法偏差，HCPPI过滤偏向低亲和/瞬时信号接触，故互作组应视为发现导向的候选清单而非已验证物理互作，需正交验证。
研究结论（译）：在上述局限下，该单实验室、单通路的蛋白质组学方法揭示了旁系同源乃至突变特异性相互作用蛋白，以及此前未描述的相互作用蛋白，为研究与炎症或发育相关的不相关信号级联串扰开辟了途径。这些结果验证了该策略，并凸显了RAStoERK.univie.ac.at提供的综合性、以通路为中心的数据集在无假设和有假设通路探究中的价值，具有发现治疗可操作机制的潜力。未来研究将聚焦于鉴定癌症相关突变体、化学RAF和MEK抑制剂或降解剂如何重塑网络，并将该信息与蛋白质组/磷酸化蛋白质组变化整合。这些结果可能为发现由癌基因或抑制剂重塑通路中的可操作脆弱性铺平道路。
