E2蛋白从TOPBP1上置换CIP2A激活乳头瘤病毒生命周期中的DNA损伤反应

《Cell Reports》：E2 displacement of CIP2A from TOPBP1 activates the DNA damage response during papillomavirus life cycles

　　

专业摘要翻译： 乳头瘤病毒的生命周期与上皮分化密切相关，病毒通过操纵分化过程以促进病毒颗粒的产生。其中一种操纵方式即激活DNA损伤反应（DDR），该反应通过同源重组（HR）促进病毒复制。本研究显示，乳头瘤病毒的转录/复制/分离因子E2能够激活DDR。在分化过程中，E2减弱去乙酰化酶sirtuin 1（SIRT1）的活性，增强DDR因子的乙酰化，并将蛋白磷酸酶2A的癌性抑制剂（CIP2A）从DNA拓扑异构酶II结合蛋白1（TOPBP1）上置换下来，导致CIP2A介导的蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制及共济失调-毛细血管扩张突变（ATM）激酶的激活。E2与TOPBP1及ATM结合，同时减少TOPBP1-ATR复合物及共济失调-毛细血管扩张和Rad3相关（ATR）激酶的激活。这种“ATM高、ATR低”的DDR表型促进病毒复制和细胞增殖。研究人员在表达E2的角质形成细胞、人乳头瘤病毒16型（HPV16）阳性细胞、小鼠乳头瘤病毒1型（MmuPV1）诱导的病变、HPV阳性头颈癌细胞系以及HPV16阳性患者来源异种移植瘤（PDX）中均观察到这种DDR激活。ATM抑制可优先杀死表达E2的细胞，支持ATM信号通路作为保留E2表达和游离基因组的HPV相关疾病的潜在治疗靶点。

论文解读：

一、研究背景与科学问题

人乳头瘤病毒（HPV）约导致5%的人类癌症，其中HPV16型最为常见。HPV的生命周期与鳞状上皮分化密切相关，病毒通过操纵分化过程以产生感染性颗粒。在病毒生命周期中，DNA损伤反应（DDR）被激活，该反应通过同源重组（HR）促进病毒基因组复制，HR因子对于病毒DNA复制和生命周期至关重要。然而，HPV激活DDR的具体机制此前尚不清楚。尽管病毒癌蛋白E6和E7在过表达时可诱导DNA损伤，但它们并不能显著激活DDR；病毒解旋酶E1的过表达虽可激活DDR，但推测是通过非特异性解旋宿主DNA所致。此前研究已报道E2在有丝分裂期间介导DDR激活，E2与TOPBP1的结合对于其与有丝分裂染色质的相互作用及质粒分离是必需的。HPV在分化上皮中诱导一种G2/M样细胞环境以促进病毒生命周期，E2在有丝分裂中激活DDR与HPV产生G2/M表型能力之间的联系，促使研究人员探究E2是否在分化角质形成细胞中激活DDR。

二、研究内容与主要结论

本研究揭示了一种全新的机制：在分化过程中，E2以依赖TOPBP1相互作用的方式激活DDR，产生“ATM上调、ATR下调”的E2 DDR表型。该活性在HPV16阳性癌前病变及HPV相关头颈癌中持续存在，这些癌症与宫颈癌不同，通常保留游离型HPV基因组。E2激活DDR所创造的ATM抑制敏感性，为对抗乳头瘤病毒感染和某些HPV诱导的癌症提供了新策略。

三、主要技术方法

本研究采用了多种关键技术方法：钙诱导角质形成细胞分化模型；器官型筏培养系统模拟上皮分化；蛋白质免疫印迹和免疫沉淀分析蛋白表达与相互作用；邻位连接技术（PLA）检测蛋白共定位；重组蛋白体外结合与竞争实验验证直接相互作用；siRNA敲低验证功能必要性；TV外切酶检测区分游离型与整合型病毒基因组；克隆形成实验评估药物敏感性。研究样本包括N/Tert-1永生化角质形成细胞系、HPV16全基因组永生化人包皮角质形成细胞（HFK+HPV16）、仅表达E6/E7的HFK细胞、W12宫颈细胞系（含游离型或整合型HPV16基因组）、UMSCC-104和UMSCC-47头颈癌细胞系、MmuPV1感染小鼠雌性生殖道组织，以及HPV16阳性口咽癌患者来源异种移植瘤（PDX）模型。

四、研究结果

E2在分化角质形成细胞中产生“ATM上调、ATR下调”表型：在稳定表达野生型E2的N/Tert-1细胞中，钙诱导分化3天后ATM水平及其磷酸化增加，CHK2和pCHK2水平相应升高，而ATR、CHK1和pCHK1水平降低。无法与TOPBP1相互作用的E2-S23A突变体不能诱导该表型，敲低TOPBP1同样消除该表型。在HFK+HPV16器官型筏培养、W12游离型细胞中均观察到相同表型，而仅表达E6/E7的细胞不能激活DDR。E2与γH2AX的邻位连接检测显示分化后核内E2-γH2AX灶点显著增加。

E2从TOPBP1置换CIP2A激活DDR：分化后，E2-WT细胞中TOPBP1与CIP2A的共免疫沉淀减弱，CIP2A与PP2A亚基B56α的相互作用增强，SIRT1与DBC1的结合增强，E2和CHK2的乙酰化水平升高。重组蛋白实验证实，磷酸化模拟突变体E2-S23D可直接竞争性置换CIP2A与TOPBP1的结合。免疫荧光和细胞分级实验显示，分化后CIP2A和B56α从细胞核转移至细胞质。

CIP2A和DBC1为E2介导的DDR激活所必需：siRNA敲低CIP2A或DBC1均可消除E2 DDR表型，并促进病毒基因组整合，表明这两个因子在控制HPV16生命周期中发挥关键作用。

E2-TOPBP1相互作用促进ATM复合物形成并使细胞对ATM抑制敏感：分化后，表达E2的细胞中TOPBP1优先与ATM形成复合物，与ATR的相互作用减少。E2可与TOPBP1和ATM形成复合物，但不能与ATR结合。ATM抑制剂AZD0156可优先杀死表达E2的细胞，而ATR抑制剂AZD6738无此效果。E2的K111乙酰化位点对于DDR表型激活至关重要。

E2介导的DDR激活机制在乳头瘤病毒感染组织中持续存在：MmuPV1感染的小鼠雌性生殖道病变组织中，mATM、mpATM、mCHK2和mpCHK2水平升高，mATR、mCHK1和mpCHK1水平降低，且TOPBP1-CIP2A复合物被破坏，DBC1-SIRT1相互作用增强，DDR相关蛋白乙酰化增强。

E2介导的DDR激活机制在HPV16癌症中持续存在：保留游离型基因组并表达E2的UMSCC-104细胞呈现E2 DDR表型，TOPBP1-CIP2A相互作用被破坏，TOPBP1与ATM而非ATR形成复合物，并对ATM抑制剂AZD0156表现出优先敏感性。HPV16阳性口咽癌PDX模型中，E2阳性肿瘤呈现相同的DDR表型和蛋白复合物重构。

五、讨论与结论

E2通过TOPBP1依赖方式激活ATM信号并抑制ATR信号。ATM激活可促进HR，有利于病毒复制；而ATR激活可感知复制压力并促进细胞周期阻滞和DNA修复，这种阻滞会阻断病毒生命周期。因此，E2开启ATM同时阻止ATR激活，是病毒对DDR的精妙调控。E2通过置换CIP2A抑制PP2A功能，促进ATM磷酸化激活，进而通过DBC1-SIRT1相互作用抑制SIRT1，增强E2和CHK2的乙酰化，进一步促进CHK2功能。尽管病毒癌蛋白可诱导DNA损伤，但本研究反复证明它们不能激活DDR，其潜在作用可能是帮助宿主基因组管理E2启动的DDR。E2 DDR表型在癌细胞中的持续存在表明，感染细胞“逃逸”分化过程后继续增殖并保持活跃的DDR。E2激活DDR所创造的ATM抑制剂敏感性，值得进一步研究作为抗病毒和抗HPV癌症治疗策略。本研究的局限性包括：未建立TOPBP1在ATM调控中的直接作用；E2显著改变多种DDR蛋白丰度，难以区分蛋白丰度变化与蛋白复合物重塑的相对贡献；E2可能通过TOPBP1以外的中介蛋白影响DDR信号；E2乙酰化突变体降低ATM和CHK2蛋白水平的具体非转录机制以及E2-TOPBP1复合物如何结构性阻断SIRT1-底物相互作用仍有待完全阐明。