人囊泡单胺转运体2（VMAT2）识别苯丙胺类兴奋剂（ATSs）及洛贝林双位点抑制的冷冻电镜机制

《Cell Reports》：Mechanisms of vesicular monoamine transporter 2 modulation by amphetamines and lobeline

　　

苯丙胺类兴奋剂（amphetamine-type stimulants, ATSs）破坏脑单胺能系统并强烈刺激动机、运动和成瘾。囊泡单胺转运体2（vesicular monoamine transporter 2, VMAT2）通过将单胺隔离于突触前囊泡，在单胺能神经传递中发挥关键作用。ATSs如何结合并调控VMAT2仍不清楚。研究人员报道人源VMAT2与四种ATSs（AMPH、METH、MDMA和MDA）及抑制剂洛贝林（lobeline）复合物的冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）结构，揭示ATSs识别和调控的分子机制。ATSs模拟单胺并占据VMAT2的底物结合位点（substrate-binding site），表明ATSs作为底物发挥作用，从而将囊泡单胺池重新分配至胞质池。洛贝林采用出乎意料的双结合模式并将VMAT2锁定于面向囊泡腔的构象，抑制单胺和ATSs摄取。研究人员的多巴胺释放实验显示，洛贝林通过调控VMAT2和多巴胺转运体（dopamine transporter, DAT）调节AMPH诱导的多巴胺释放。该研究为苯丙胺类药物和洛贝林对VMAT2的调控提供重要机制见解。

单胺能神经传递涉及突触前囊泡释放、单胺再摄取转运体（monoamine reuptake transporters, MATs）清除递质以及囊泡单胺转运体2（vesicular monoamine transporter 2, VMAT2）将胞质单胺隔离入囊泡，与抑郁、焦虑、精神分裂症和帕金森病等相关。苯丙胺类兴奋剂（amphetamine-type stimulants, ATSs）包括苯丙胺（AMPH）、甲基苯丙胺（METH）、3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺（MDMA）和3,4-亚甲二氧基苯丙胺（MDA），可劫持单胺能传递并导致大量单胺释放；其经MATs进入神经元、抑制单胺氧化酶（monoamine oxidases, MAOs），并被VMAT2转运入囊泡，进而改变MATs功能、促进反向转运。VMAT2是ATSs的重要靶点，但广谱ATSs如何结合VMAT2及洛贝林（lobeline）如何拮抗尚不清楚。该研究解析人源VMAT2与四种ATSs及lobeline复合物结构，并结合功能实验阐明识别和抑制机制，为成瘾和神经精神疾病靶向VMAT2提供基础。

关键技术方法：在HEK293F中表达纯化人源VMAT2，采用冷冻电镜（cryo-electron microscopy, cryo-EM）单颗粒分析解析VMAT2与AMPH、METH、MDMA、MDA及lobeline复合物结构；在HEK293F/HEK293T细胞中开展[³H]-多巴胺（dopamine, DA）摄取、药物诱导释放及突变体功能实验；用显微热泳（microscale thermophoresis, MST）测定lobeline与VMAT2结合亲和力。样本来源为商业化HEK293F、HEK293T和Sf9细胞系，未涉及临床队列。

1. 人源VMAT2与ATSs结合的冷冻电镜结构。100 μM AMPH、METH、MDMA和MDA使VMAT2^WT的[³H]-DA摄取下降约60%–80%；AMPH的半数抑制浓度（IC₅₀）为22.87±1.15 μM。解析的四种复合物核心区分辨率优于2.8 ?，均呈面向囊泡腔构象，中央腔可见匹配的配体密度。

2. ATSs在VMAT2中识别的结构基础。四种ATSs均位于C结构域由TM7–11形成的电负性中央底物结合口袋，与5-羟色胺（serotonin, 5-HT）和DA结合模式相似；共享胺基与N305、D399和Y433发生极性作用，苯环核心与V232、I308和Y341发生疏水作用。METH和MDMA的胺基甲基引入轻微位阻并扰动Y341；MDMA和MDA的3,4-亚甲二氧基使E312和F334局部构象变化，分别与S338和E312形成额外氢键。VMAT2与VMAT1差异残基V232/I308/Y433对应L240/V316/F441；Y433F使AMPH的IC₅₀升至131.4 μM，约为VMAT2^WT的6倍。该研究结构总体与Ye et al.报道的VMAT2^AMPH相似，但Y433侧链取向存在差异。

3. 洛贝林抑制VMAT2的结构基础。lobeline抑制[³H]-DA摄取的IC₅₀为6.67±1.10 μM；VMAT2^LOB结构分辨率3.03 ?，呈面向囊泡腔构象，中央腔可见两个lobeline密度：lobeline1位于腔侧，lobeline2嵌入底部。lobeline1与L37、L228、V232、L331、F334、V391、Y433作用，E312与其哌啶叔胺有潜在静电作用，并与lobeline2堆叠；lobeline2在底物口袋与Y341发生π-π堆积、与Y433形成氢键，并与I301、I308、M403、A425、F429疏水作用，D399与其羟基和叔胺发生极性作用。I308A和A337L分别使lobeline效力降低3.3和4.3倍，A425L影响可忽略；MST测得VMAT2^WT的解离常数（K_d）约5.69 μM，A337L未能可靠拟合。lobeline完全占据底物结合口袋并锁定VMAT2于面向囊泡腔状态，从而竞争性抑制。

4. 洛贝林调节AMPH诱导的DA外流。在仅表达DAT或共表达VMAT2/DAT的HEK293T细胞中，100 μM AMPH强烈促进[³H]-DA释放；50 μM lobeline与100 μM AMPH共处理未显著增强VMAT2/DAT共表达细胞的DA释放，而500或1,000 μM lobeline显著降低VMAT2/DAT共表达细胞及DAT单独表达细胞的ATSs诱导DA外流。10 μM AMPH与50 μM lobeline共处理时，DAT单独表达细胞无显著变化，VMAT2/DAT共表达细胞DA释放显著进一步增加。结果提示lobeline对ATSs诱导外流的增强依赖VMAT2，并呈浓度依赖：较低浓度经VMAT2介导胞质DA累积而增强，较高浓度通过直接抑制DAT而抑制释放。

讨论部分总结：该研究显示四种ATSs共享中央底物口袋，作为VMAT2底物竞争性抑制单胺转运；Y433与AMPH的氢键至少部分解释VMAT2较VMAT1高约20倍的表观亲和力。与Ye et al.的E312质子化模型不同，作者基于四种ATSs复合物及单胺复合物中胺基与D399的保守静电作用，提出D399而非E312为主要质子化位点。lobeline双分子堆叠形成不同于利血平（reserpine, RES）、四苯喹嗪（tetrabenazine, TBZ）和酮色林（ketanserin, KET）的结合模式：lobeline1部分覆盖TBZ位点并阻止腔侧门关闭，lobeline2占据单胺结合位点并楔入内部，解释其竞争性抑制；其亲脂性可能有利于从囊泡腔侧进入腔。作者同时指出纯化去垢剂胶束缺乏跨膜质子梯度（ΔpH）和膜电位（Δψ）、0.2 mM lobeline孵育及A337L仅降低效力约3倍，使lobeline1作为次级低亲和位点的可能性不能排除。异源系统中低浓度lobeline增强AMPH诱导DA释放、高浓度抑制，体内外差异可能与囊泡分隔不完全、烟碱受体拮抗及去甲肾上腺素能/5-HT能作用有关。局限性包括缺少闭锁态和胞质面向态ATSs复合物、双结合模式生理意义待验证、异源系统不能代表天然神经元。

研究结论翻译：总之，该研究提供了ATSs识别及lobeline抑制VMAT2的结构见解，为解析苯丙胺成瘾的复杂药理学和开发针对成瘾的靶向干预提供了结构基础。