《Pathogens》：Toll-like Receptor 9 in Patients with Laryngeal Cancer in Relation to Epstein–Barr Virus DNA
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摘要：近期证据一致表明，喉癌（laryngeal cancer, LC）预防与控制效果提升的一大障碍在于该疾病的病因尚不明确。本研究旨在评估EB病毒（Epstein–Barr virus, EBV）DNA阳性组与EBV DNA阴性组中，携带Toll样受体9（T
摘要：近期证据一致表明，喉癌（laryngeal cancer, LC）预防与控制效果提升的一大障碍在于该疾病的病因尚不明确。本研究旨在评估EB病毒（Epstein–Barr virus, EBV）DNA阳性组与EBV DNA阴性组中，携带Toll样受体9（Toll-like receptor 9, TLR9）表达的淋巴细胞（CD19+、CD4+CD3+、CD8+CD3+）比例、EBV DNA状态以及CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODN）刺激细胞后的细胞因子分泌情况。研究证据表明，TLR9的表达可能决定EBV DNA阳性喉癌患者淋巴细胞的活化状态。
论文解读：喉癌中TLR9表达与EBV DNA状态的相关性研究
一、研究背景与问题
喉癌（laryngeal cancer, LC）属于头颈部恶性肿瘤范畴，约占头颈部恶性肿瘤的三分之一。全球每年新发喉癌约188,960例，年死亡人数约103,216例。尽管治疗手段不断进步，喉癌患者5年总体生存率仅为50%–80%，这主要归因于晚期确诊和初治后两年内的高复发率。吸烟、饮酒、人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）和EB病毒（Epstein–Barr virus, EBV）感染被认为是喉癌的主要危险因素。
EBV是一种普遍存在的病原体，感染全球90%以上的人口，主要通过唾液传播。EBV通常感染上皮细胞和B细胞，但T细胞和自然杀伤（natural killer, NK）细胞也可作为EBV的靶细胞。EBV在记忆B细胞中维持终身潜伏感染，并可能重新激活感染初始B细胞。EBV与多种恶性肿瘤的发生发展相关，包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）和胃癌。研究人员前期研究已表明，EBV感染可能影响免疫检查点调节因子水平及喉癌的发生发展。
Toll样受体（Toll-like receptors, TLRs）是先天性和适应性免疫反应对抗癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病的关键元件。TLRs属于模式识别受体家族，通过识别配体启动先天免疫反应。人类已鉴定出10种功能性TLRs，根据细胞定位分为细胞表面TLRs（TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR11）和内涵体TLRs（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9）。TLR9作为内涵体受体，识别未甲基化CpG DNA，在B细胞活化中发挥重要作用。TLR信号通路激活后，通过MyD88依赖性途径导致转录因子NF-κB活化，进而促进炎性细胞因子如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）、白细胞介素（interleukin, IL）-6、IL-1β、干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）、IL-12等的产生。
免疫检查点分子如程序性细胞死亡蛋白1（programmed cell death 1, PD-1）及其配体PD-L1在维持免疫稳态中起关键作用。在癌症和慢性感染条件下，持续的T细胞受体（T cell receptor, TCR）刺激导致效应功能逐渐丧失，即“耗竭”状态。目前针对PD-1、PD-L1和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4）的免疫治疗虽已改善癌症生存率，但免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor, ICI）治疗响应率仅为20%–30%，因此需要新的联合治疗策略。
基于上述背景，本研究旨在根据EBV DNA状态，分析喉癌患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中TLR9表达及CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODN）刺激后的细胞因子分泌情况。
二、研究内容与结论
研究人员招募了40例喉鳞状细胞癌患者（均为男性，中位年龄60.75岁，范围50–69岁），分为EBV感染组（20例）和非EBV感染组（20例），并以20例鼻中隔畸形住院患者作为对照组。EBV阳性定义为PBMC中EBV DNA阳性、抗VCA IgM阳性和抗VCA IgG阳性；EBV阴性定义为PBMC中EBV DNA阴性、抗VCA IgM阴性和抗VCA IgG阳性。所有患者均为T3和T4分期。
研究发现，喉癌患者中TLR9+和PD-1+淋巴细胞百分比显著高于对照组。在EBV DNA阳性组中，CD8+TLR9+ T淋巴细胞和CD19+TLR9+ B淋巴细胞百分比显著高于EBV DNA阴性组。同时，EBV DNA阳性组中PD-1+ T淋巴细胞（CD4+）、PD-1+ T淋巴细胞（CD8+）和PD-1+ B淋巴细胞（CD19+）百分比均显著高于EBV DNA阴性组。
在细胞因子分泌方面，ODN2216刺激后EBV DNA阳性喉癌患者的IL-6浓度显著高于EBV DNA阴性患者。然而，EBV DNA阳性组中ODN2216刺激与未刺激培养的IL-6比值显著低于EBV DNA阴性组。同样，EBV DNA阳性组中ODN2216刺激与未刺激培养的IL-10比值也显著低于EBV DNA阴性组。
通过受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）分析，研究人员确定了与EBV DNA状态相关的TLR9+淋巴细胞百分比最佳阈值：CD8+TLR9+ T淋巴细胞百分比阈值>2.35（AUC=0.710，95% CI: 0.546–0.874，p=0.0121），CD19+TLR9+ B淋巴细胞百分比阈值>9.67（AUC=0.776，95% CI: 0.621–0.931，p=0.0005）。
根据上述阈值分组分析发现，CD8+CD3+TLR9+<2.35%组中ODN2216刺激与未刺激培养的IL-6比值显著升高，而CD8+CD3+TLR9+>2.35%组中IL-6浓度显著高于<2.35%组。CD19+TLR9+<9.67%组中IL-6比值更高。IL-10浓度在各组间无统计学显著差异。
三、主要技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：流式细胞术（flow cytometry）分析PBMCs中CD19+、CD4+CD3+、CD8+CD3+淋巴细胞亚群上TLR9和PD-1的表达百分比；密度梯度离心法分离PBMCs并进行体外培养，以TLR9激动剂ODN2216刺激48小时后收集上清；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）检测培养上清中IL-6和IL-10浓度；实时荧光定量PCR（real-time PCR）检测PBMCs中EBV DNA拷贝数；ELISA检测血浆中抗EBV VCA IgM和IgG抗体；统计学分析采用Shapiro–Wilk检验评估数据正态性，Mann–Whitney U检验进行组间比较，ROC分析确定最佳截断值。样本来源为波兰卢布林医科大学耳鼻喉科和肿瘤科。
四、讨论与结论
讨论部分指出，EBV感染通过TLR9识别是导致炎症反应的生理事件。EBV感染B细胞可诱导NF-κB活化并抑制TLR9转录，从而下调炎症反应，这可能是EBV建立持续感染的机制之一。TLR激活可触发EBV感染B细胞的增殖增强，增加B细胞表面共刺激配体表达，可能促进细胞毒性T细胞对感染B细胞的免疫控制。
研究还讨论了IL-6的双重作用：高浓度IL-6可增加CD8+ T细胞对凋亡的敏感性，抑制CD8+ T细胞的细胞因子产生和增殖。TLR信号也可能涉及免疫抑制策略，包括上调T细胞抑制分子PD-L1，导致T细胞免疫抑制和效应杀伤能力减弱。
研究人员观察到EBV DNA阳性患者中PD-1+淋巴细胞百分比更高，提示持续高抗原负荷诱导的PD-1上调可能导致免疫系统功能恶化。IL-6可促进病毒感染后PD-1和PD-L1的最大化上调。TLR激动剂可模拟EBV介导的单核细胞PD-L1上调效应，表明TLR信号在EBV诱导的PD-L1上调中可能发挥重要作用。
研究结论认为，细胞内EBV DNA影响免疫系统的调节，并可干扰对TLR刺激的有效反应。TLR9+细胞百分比的差异可能作为确定喉癌患者细胞活化免疫反应的重要工具。由于纳入患者数量有限、缺乏多重比较校正以及ROC衍生截断值的探索性，仍需进一步研究阐明EBV DNA阳性PBMCs是否与喉癌中TLR9细胞相关。尽管初步研究提示细胞内EBV DNA可能在喉癌TLR9相关免疫反应中发挥作用，但尚未提供独立验证数据支持这一发现。
