MUC5B表达与呼吸道合胞病毒感染减轻及肺部炎症的相关性研究

《Pathogens》：MUC5B Expression Is Associated with Reduced Respiratory Syncytial Virus Infection and Pulmonary Inflammation

　　

呼吸道合胞病毒（RSV）是导致严重下呼吸道疾病的主要原因，尤其在婴幼儿和老年人中。在RSV感染过程中，凝胶形成黏蛋白的过度分泌和积累可阻塞小气道并促进肺部病理改变。然而，气道黏蛋白也构成一道一线屏障，能够捕获吸入病原体并限制其进入气道上皮。MUC5B作为下呼吸道主要的分泌型黏蛋白，是否影响RSV感染及相关肺部反应尚不清楚。本研究利用稳定过表达MUC5B的人A549上皮细胞和雌性Muc5b基因缺陷小鼠，探讨了MUC5B在RSV感染中的作用。MUC5B过表达显著降低了A2、Long和B1株RSV感染后的细胞内RSV RNA水平。体内实验表明，感染后第5天，Muc5b?/?小鼠肺部RSV RNA载量显著升高，而鼻甲中未检测到显著的基因型依赖性差异。Muc5b缺陷还与更严重的呼吸道病理改变以及RSV感染后肺部中性粒细胞比例升高相关。感染后野生型和Muc5b?/?小鼠的嗜酸性粒细胞比例均增加，肺泡巨噬细胞比例下降，间质巨噬细胞比例上升。综上所述，这些发现表明，尽管过量黏液积聚会导致气道阻塞，但MUC5B在RSV感染中也具有保护作用。MUC5B可能通过增强气道屏障功能、降低肺部病毒载量、限制组织损伤以及减弱中性粒细胞炎症来提高肺部对RSV的抵抗力。这些发现将MUC5B鉴定为黏膜抗病毒防御的重要组成部分，并拓宽了对气道黏蛋白如何影响RSV感染易感性的理解。

研究背景与科学问题

呼吸道合胞病毒（RSV）是一种包膜负链单链RNA病毒，属于肺病毒科，是全球范围内婴幼儿、免疫功能低下者及老年人急性下呼吸道感染、细支气管炎和肺炎的主要病因。尽管近年来在预防干预措施方面取得了进展，包括单克隆抗体和疫苗，但对已发生的RSV感染的治疗仍主要为支持性治疗，这凸显了开发宿主导向的黏膜策略以预防或限制重症疾病的必要性。

气道黏液凝胶层是抵御吸入性病毒病原体的关键局部呼吸防御组分。黏蛋白是该层的主要结构成分，通过捕获、滞留并促进清除入侵病原体参与先天免疫。气道黏液中包含两种主要的聚合凝胶形成黏蛋白——MUC5AC和MUC5B，它们在呼吸道内具有不同的空间分布和功能。MUC5AC主要由近端气道的表面杯状细胞产生，并在2型炎症反应中快速分泌；而MUC5B由远端细支气管的分泌细胞和黏膜下腺体组成性产生，在下呼吸道中维持基线黏液流变学和黏液纤毛清除功能。

气道黏蛋白通过捕获吸入病毒颗粒并限制其进入气道上皮，形成抵抗呼吸道病毒的关键一线屏障。这种保护功能已在流感和鼻病毒感染中得到证实。然而，病毒感染后黏蛋白的过度产生可能是有害的，导致黏液积聚、清除受损，最终引起气道阻塞。RSV感染显著改变了气道黏蛋白的表达谱。对人肺组织的研究表明，RSV在mRNA和蛋白质水平上均可诱导MUC5B和MUC5AC的显著上调。值得注意的是，RSV感染肺部中阻塞气道和肺泡空间的黏液主要由MUC5B组成，提示MUC5B过度积聚与RSV相关气道阻塞有关。相反，也有研究报告RSV感染期间MUC5B表达降低。尽管黏蛋白的抗病毒屏障功能已在流感和鼻病毒感染中得到研究，但MUC5B是否同样限制RSV进入或早期感染仍未知。因此，一个重要的未解问题是：急性RSV感染期间MUC5B产生的改变究竟是主要导致病理性气道堵塞，还是同时支持宿主的抗病毒防御。

基于凝胶形成黏蛋白的高度糖基化结构及其在呼吸道黏膜防御中的既定作用，研究人员假设MUC5B在RSV早期感染中参与宿主防御，且Muc5b缺陷将导致病毒载量和肺组织损伤增加。为了评估独立于纤毛介导运输的影响，研究人员构建了稳定过表达MUC5B的A549细胞，并检测其对三种RSV毒株的易感性。随后，研究人员使用C57BL/6背景的纯合（Muc5b^?/?）和杂合（Muc5b^+/?）小鼠，评估Muc5b表达、RSV RNA载量、呼吸道病理改变及肺部免疫细胞组成之间的关系。研究结果支持MUC5B在肺部抵抗RSV感染中的保护作用，并为气道黏蛋白在黏膜抗病毒防御中的贡献提供了见解。

主要关键技术方法

1. 1.
   体外细胞模型：通过慢病毒载体转导构建稳定过表达MUC5B的人A549上皮细胞系（A549-MUC5B-1和A549-MUC5B-2）。
2. 2.
   动物模型：使用SPF级雌性C57BL/6背景的野生型（Muc5b^+/+）、杂合（Muc5b^+/?）和敲除（Muc5b^?/?）小鼠，经鼻接种RSV A2株（1×10⁶ TCID₅₀/只），并于感染后第5天取样分析。
3. 3.
   定量实时PCR（qRT-PCR）：用于检测细胞和肺组织中MUC5B、RSV N基因及Muc5ac的mRNA表达水平。
4. 4.
   Western Blotting：验证MUC5B蛋白在过表达细胞系中的表达。
5. 5.
   组织病理学评估：通过苏木精-伊红（H&E）染色评估鼻腔和肺组织的病理变化，采用高碘酸-雪夫（PAS）染色评估黏液相关病理，并由病理学家进行盲法半定量评分。
6. 6.
   多色流式细胞术：分析肺组织单细胞悬液中中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肺泡巨噬细胞（AMs）和间质巨噬细胞（IMs）的比例。

研究结果

3.1 MUC5B过表达与体外RSV RNA水平降低相关

为评估MUC5B是否独立于黏液纤毛运输影响RSV感染，研究人员构建了两种稳定过表达MUC5B的A549细胞系，并通过RT-qPCR和Western Blotting确认过表达。随后，用RSV A2、Long和B1毒株以MOI 0.01感染细胞。RT-qPCR分析显示，与野生型和空载体对照相比，MUC5B过表达细胞在感染后24小时，所有三种毒株的细胞内RSV N基因RNA水平均出现适度但可重复的降低。为进一步确定MUC5B是否影响RSV感染的早期阶段，研究人员检测了病毒附着步骤。结果表明，对于所有三种测试的RSV毒株，MUC5B过表达均显著降低了细胞相关的RSV水平。这表明MUC5B可能部分限制RSV进入或附着于上皮细胞表面。

3.2 Muc5b缺陷与体内肺部RSV RNA载量增加相关

为在生理性黏膜环境中验证上述发现，研究人员对野生型、杂合和敲除小鼠经鼻接种RSV A2毒株，并在感染后第5天进行分析。免疫组化染色证实了Muc5b在野生型和杂合小鼠肺部的表达，而在敲除小鼠中无信号。RT-qPCR结果显示，各组鼻甲中的RSV RNA水平无显著差异；然而，敲除小鼠肺部的RSV RNA载量显著高于野生型小鼠，表明Muc5b缺陷与下呼吸道RSV载量增加相关。

3.3 Muc5b缺陷与小鼠更严重的RSV相关呼吸道病理改变相关

H&E染色评估显示，RSV感染的敲除小鼠鼻腔组织病理学评分显著高于感染野生型小鼠。杂合和敲除小鼠的肺部组织病理学评分均显著高于野生型小鼠。PAS染色用于评估黏液相关病理。各组鼻腔中未见显著差异；然而，RSV感染的杂合小鼠肺部PAS阳性黏液相关物质显著增加。进一步的RT-qPCR分析显示，与感染野生型小鼠相比，感染敲除小鼠肺部的Muc5ac mRNA表达显著上调（p < 0.001）。这表明Muc5b缺陷伴随着RSV感染后Muc5ac的代偿性上调，这可能导致了敲除小鼠肺部观察到的PAS阳性物质增加。值得注意的是，杂合小鼠并未始终表现出介于野生型和敲除小鼠之间的中间表型，表明病理变化不遵循简单的线性基因剂量模式。

3.4 Muc5b缺陷与RSV感染期间肺部中性粒细胞比例增加相关

通过多色流式细胞术分析感染后第5天肺部的炎症细胞组成。在RSV感染动物中，敲除小鼠肺部中性粒细胞的比例显著高于野生型小鼠，表明Muc5b缺陷与RSV感染期间更强的中性粒细胞炎症反应相关。相比之下，两组感染小鼠的嗜酸性粒细胞比例无显著差异，但均高于各自的模拟感染对照组，提示这一变化主要与RSV感染相关，而非Muc5b基因型。对肺部巨噬细胞亚群的分析显示，RSV感染后野生型和敲除小鼠的肺泡巨噬细胞比例均显著下降，同时伴随间质巨噬细胞比例的增加。由于两种基因型的变化相似，肺泡巨噬细胞的减少和间质巨噬细胞的增加似乎是RSV相关肺部巨噬细胞区室重塑的一般特征，而非Muc5b缺陷的特异性反应。

讨论与结论

讨论部分指出，MUC5B是一种主要的凝胶形成黏蛋白，有助于气道黏液组织、黏液纤毛运输和肺部宿主防御。尽管其在维持气道稳态中的作用已明确，但其与急性RSV感染的关系尚不完全清楚。本研究发现MUC5B表达与体外较低的RSV RNA水平相关，而Muc5b缺陷与增加的肺部RSV RNA载量、更严重的呼吸道病理改变以及RSV感染后更高的肺部中性粒细胞比例相关。这些发现共同支持MUC5B与肺部抵抗RSV的保护性关联。

体外实验中，MUC5B过表达与细胞内RSV RNA水平降低相关，且附着实验表明MUC5B的作用在感染的早期阶段即可检测到，表现为部分限制病毒进入或附着于上皮细胞表面。由于A549细胞缺乏功能性黏液纤毛清除，观察到的效果可能反映了非纤毛依赖机制，如细胞外捕获、空间位阻或糖基依赖的相互作用。然而，本研究未直接评估MUC5B与RSV病毒粒子或表面糖蛋白的结合，因此糖基依赖相互作用的贡献尚待确定。

一个值得注意的发现是Muc5b缺陷与RSV RNA载量之间存在组织特异性关联。病毒RNA载量增加仅在肺部而非鼻甲中检测到，这与气道黏蛋白组成和功能的区域差异一致。MUC5B是下呼吸道主要的凝胶形成黏蛋白，而上呼吸道含有更多样的黏蛋白环境，其中MUC5AC和其他黏液成分可能部分补偿Muc5b缺陷。这些区域差异解释了为何MUC5B的保护性关联在远端气道更为明显。

除了更高的肺部RSV RNA载量，Muc5b缺陷还与更严重的气道病理改变相关。杂合子表型进一步表明，Muc5b表达与RSV相关病理之间的关系并非简单的剂量依赖关系。部分Muc5b缺失可能足以破坏黏液稳态和组织反应，而完全缺失则可能产生额外或性质不同的效应。在Muc5b缺陷肺部观察到的PAS阳性黏液相关物质增加出乎意料，因为失去了一个主要的凝胶形成黏蛋白。研究表明，RSV感染敲除小鼠肺部的Muc5ac mRNA表达显著上调，支持了Muc5b缺失后存在代偿性黏蛋白反应的观点。

在炎症反应方面，RSV感染敲除小鼠的肺部中性粒细胞比例更高。过度的中性粒细胞炎症是严重RSV疾病的特征，可通过释放蛋白酶、活性氧和中性粒细胞胞外陷阱导致组织损伤。敲除小鼠中更高的中性粒细胞比例可能与其更严重的肺部病理相关。而巨噬细胞亚群的变化（肺泡巨噬细胞减少，间质巨噬细胞增加）在两种基因型中均观察到，表明这是RSV感染期间肺部巨噬细胞区室广泛重塑的结果，而非Muc5b缺陷特异。

研究结论为：本研究将MUC5B鉴定为宿主抵抗RSV感染的重要组分。研究结果表明，MUC5B与降低的肺部病毒载量、较轻的呼吸道损伤以及减弱的嗜中性粒细胞炎症相关。这些发现推进了对RSV感染期间气道黏液屏障介导的先天防御的理解。