基于宏基因组测序的恩加米兰与奥卡万戈三角洲地区地表水及人血浆病原菌与耐药决定因子监测研究

《Pathogens》：Surveillance of Pathogenic Bacteria and Antimicrobial Resistance Determinants in Surface Water and Human Plasma Using Metagenomic Sequencing in the Ngamiland and Okavango Delta Regions

　　

摘要翻译：
（1）背景：抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）对全球公共卫生构成严重威胁，地表水可能作为致病菌、人兽共患病原体及AMR决定因子的储存库，并构成人与动物之间的传播途径。研究人员旨在检测地表水与人类样本中临床相关分类群的细菌DNA及推定AMR决定因子，以支持在恩加米兰（Ngamiland）与奥卡万戈三角洲（Okavango Delta）地区扩展一体化健康（One Health）环境监测。（2）方法：研究人员开展了一项横断面环境监测研究，采用宏基因组测序技术。共采集28份地表水样本，分别来自塔马拉卡内河（Thamalakane River）和莫雷米动物保护区（Moremi Game Reserve）的采样点：其中12份来自沿塔马拉卡内河的Mall of Maun、Island Safari Lodge和Police Bridge采样点，16份来自莫雷米动物保护区的Xakanaxa、Maxwexwana、Paradise和Jessie’s Pools采样点。此外，对来自马翁（Maun）Letsholathebe II纪念区医院的72份人血浆样本进行了测序。采用Kraken2进行分类学注释，并使用CZ ID AMR模块进行预测性AMR基因鉴定。Beta多样性通过主坐标分析（Principal Coordinates Analysis, PCoA）和PERMANOVA评估细菌及AMR基因组成的显著差异，p值小于0.05视为具有统计学显著性。（3）结果：塔马拉卡内河以Acinetobacter schindleri（约27%）、Acinetobacter lwoffii（约67%）和产毒蓝藻Microcystis aeruginosa（约99%）为主。莫雷米动物保护区显示出更高的细菌多样性，包括两个位点的Stenotrophomonas maltophilia（约26%和约29%）、Microcystis aeruginosa（约60%）、P. aeruginosa（约20%）、P. putida（约13%）和A. baumannii（约10%）。Beta多样性分析显示不同地点之间的细菌群落存在显著差异（PERMANOVA: R2 = 0.261, p = 0.001）。在地表水与人血浆样本中仅鉴定出28种细菌物种中的5种为共有。人类样本中未检测到推定AMR基因。然而，地表水中仅以内在外排泵基因（mex-、sme-、ade-家族等）为主。AMR beta多样性与地点显著相关（PERMANOVA: R2 = 0.101, p = 0.007），但仅解释了所观察变异的一小部分。（4）结论：在地表水和人类样本中检测到临床相关细菌类群的细菌DNA，且仅在地表水样本中检测到推定AMR决定因子，这凸显了扩展一体化健康环境监测的必要性。尽管在人血浆中未检测到推定AMR基因，但监测病原体及耐药相关基因在一体健康界面之间的出现和传播仍是一个需要进一步研究的重要领域。

论文解读：
抗菌药物耐药性（antimicrobial resistance, AMR）已成为全球公共卫生的重大威胁，2019年全球因AMR细菌导致127万人死亡，预计到2050年这一数字可能升至1000万。博茨瓦纳等中低收入国家承受着沉重的AMR负担，2021年该国约有283例死亡可归因于AMR。尽管博茨瓦纳于2024年12月签署了国家AMR行动计划，强调通过废水/水监测加强耐药知识，但目前仅有极少的环境AMR数据被提交至全球抗菌药物耐药性及使用监测系统（GLASS）。恩加米兰（Ngamiland）与奥卡万戈三角洲地区因人与动物高频率互动而成为人兽共患病原体溢出的常见区域，塔马拉卡内河（Thamalakane River）作为人类、家养动物和野生动物共享的水源，可能成为病原菌和AMR基因传播的潜在储存库。然而，该地区的高通量测序应用极为有限，仅有一项研究利用宏基因组测序分析了奥卡万戈三角洲季节性水塘的病毒生态。因此，本研究旨在通过宏基因组测序表征地表水与人血浆样本中的细菌群落，重点检测临床相关及人兽共患细菌、循环中的推定AMR决定因子，并探索环境中与人类之间病原体和耐药基因的可能重叠，为扩展一体化健康（One Health）环境监测提供基线证据。
研究人员开展了一项横断面环境监测研究，于2025年3月从塔马拉卡内河3个采样点（Mall of Maun、Island Safari Lodge、Police Bridge）采集12份地表水样本，并从莫雷米动物保护区4个采样点（Xakanaxa、Maxwexwana、Paradise、Jessie’s Pools）采集16份地表水样本，每份原始样本分成4个重复（A-D），共112份处理亚样本。此外，于2025年8月从Letsholathebe II纪念区医院收集72份人血浆样本，采样对象为居住于距塔马拉卡内河不足1公里且患有随机疾病的个体。样本经离心浓缩后，使用DaAn Gene离心柱试剂盒提取DNA，采用Illumina COVIDSeq?试剂盒构建文库并进行宏基因组测序。生物信息学分析使用Kraken 2.17.1（基于k-mer的分类工具，参考数据库K2 EuPathDB version 48）进行细菌分类学注释，并使用CZ ID AMR模块（整合CARD数据库及RGI软件6.0.0版，AMR pipeline 1.2.4版）检测推定AMR基因。统计方面，采用Bray-Curtis相异度主坐标分析（PCoA）和PERMANOVA（999次置换）评估细菌群落和AMR基因组成的差异，p小于0.05为显著性阈值。
研究结果部分如下：
3.1 各采样点的相对丰度：共从28份地表水样本中检测到29种独特细菌分类群。塔马拉卡内河的Island Safari和Police Bridge位点以Acinetobacter schindleri（约27%）和Acinetobacter lwoffii（约67%）为主，而Mall of Maun位点由产毒蓝藻Microcystis aeruginosa（约99%）主导。莫雷米动物保护区的Jessie’s和Xakanaxa Pool以Stenotrophomonas maltophilia为主（分别约26%和约29%），Maxwexwana Pool由Microcystis aeruginosa主导（约60%），Paradise Pool则呈现更均匀的分布，包括S. maltophilia、P. aeruginosa（约20%）、P. putida（约13%）和A. baumannii（约10%）。
3.2 不同地点的细菌群落组成：基于29种独特细菌分类群的Beta多样性分析显示，塔马拉卡内河与莫雷米动物保护区之间的细菌群落组成存在明显分离。PCoA1和PCoA2分别解释27.6%和18.8%的变异，合计46.4%。PERMANOVA结果显示采样地点与细菌群落组成显著相关（R2 = 0.261，p = 0.001），但仅解释了约26%的beta多样性；beta离散度检验不显著（p = 0.061），表明该结果并非由组间方差不齐导致。
3.3 不同样本类型的细菌物种相对丰度：在塔马拉卡内河与人血浆样本中共检测到28种独特细菌物种。人血浆样本中以Serratia liquefaciens为主（约65%），其次为Staphylococcus aureus（约6%）、Stenotrophomonas maltophilia（约6%）、Acinetobacter variabilis、Acinetobacter lwoffii（约6%）和Acinetobacter baumannii（约4%）。而塔马拉卡内河以多种Acinetobacter spp.为主，合计约占群落的85%，其中A. lwoffii最丰富（约53%），其次为A. variabilis（约29%）和A. schindleri（约3%），Microcystis aeruginosa约占12%。
3.4 细菌物种的重叠：共鉴定28种细菌物种，其中19种仅存在于塔马拉卡内河水，4种仅存在于人血浆，5种为共有，包括Acinetobacter baumannii、Acinetobacter lwoffii、Acinetobacter schindleri、Acinetobacter variabilis和Stenotrophomonas maltophilia。共有多重耐药相关S. maltophilia和临床相关A. baumannii的检出提示分类学上的重叠，但尚不能确定传播关系或直接流行病学联系。
3.5 推定的AMR基因相对丰度：从28份地表水样本中共检测到30个推定AMR基因，而人血浆样本中未检出。内在外排泵系统是最主要的耐药机制。Jessie’s Pool仅由外排泵基因mdtB主导；Xakanaka、Paradise和Maxwexwana Pool各检出两个基因（包括mex、mux、AxyX和RanA）；Mall of Maun以RanA基因为主；Police Bridge和Island Safari Lodge检出多个推定AMR基因，包括mex-、sme-、ade-家族外排泵基因、OXAβ-内酰胺酶基因及与脂多糖（LPS）合成相关的LpsB基因。所有检出的耐药机制均为内在性质，其检测反映基因组潜力而非已确认的表型耐药。
3.6 不同地点的推定AMR基因组成：基于30个AMR基因的Beta多样性分析显示，PCoA1和PCoA2分别解释17.8%和15.8%的变异，合计33.6%。莫雷米动物保护区样本大多聚于左侧，而塔马拉卡内河样本分散于右上区域，表明河流位点耐药基因组成变异更大。PERMANOVA结果显示地点对耐药相关基因组成有统计学显著影响（R2 = 0.101，p = 0.007），但仅解释了约10.1%的变异；beta离散度检验不显著（p = 0.403）。
讨论部分指出，塔马拉卡内河与莫雷米动物保护区细菌群落的明显生态结构差异可能源于人为压力与理化学条件的差异，如土地利用、可生物降解污染物、温度和pH。地表水与人血浆中五种共有物种提示潜在的人-环境重叠，但由于未进行血培养，不能确认活微生物或菌血症的存在。地表水样本中检出的AMR基因以内在外排泵为主，莫雷米保护区低人类活动区域的耐药组多样性较低，而塔马拉卡内河高人类活动区域检出更多样的耐药基因，包括OXA基因和LpsB基因，这可能与人类活动（灌溉、畜牧、娱乐）有关，但需注意这些均为内在机制而非获得性移动耐药基因。AMR基因组成在地点间存在重叠且PERMANOVA解释率低，提示除地理位置外的其他因素（如废水排放、动物移动、人类活动）也在影响耐药基因的分布。
研究结论总结如下：总体而言，恩加米兰与奥卡万戈三角洲的地表水含有世界卫生组织（WHO）临床相关和人兽共患细菌，包括Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa、Klebsiella pneumoniae和Leptospira santarosai，其中五种物种在水与人血浆中共享，包括临床相关的A. baumannii和新兴多重耐药S. maltophilia。但需要注意的是，人血浆是低微生物生物量基质，样本检测结果应谨慎解释，以防处理过程中可能存在的污染。尽管结果需谨慎对待，但研究遵循无菌技术并妥善处理样本以减少污染，因此并不否定结果的重要性。所有地表水样本均检出耐药相关基因，但人血浆样本中未检出推定AMR基因。检测到的外排泵主要为内在的、染色体编码的调控系统，与Acinetobacter、Pseudomonas、Burkholderia及相关属相关，未检测到获得性移动耐药基因（如mcr或超广谱β-内酰胺酶）。低多样性、低影响的莫雷米动物保护区与较高多样性、受人类影响的塔马拉卡内河之间的比较表明，人类活动可能与微生物群落及耐药相关基因相关联，支持了更广泛的一体化健康环境监测方法。由于样本量小、横断面设计、缺乏动物样本及仅检出内在耐药机制，这些结果应视为初步而非结论性。未来研究应纳入前瞻性的人口学和临床数据收集，以加强流行病学推断。