《Pathogens》：Protective Efficacy of Recombinant Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase Vaccine Against Vibrio alginolyticus in Asian Seabass (Lates calcarifer)
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由溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）引起的弧菌病是尖吻鲈（Lates calcarifer）养殖中的主要细菌性疾病，并导致重大的经济损失。抗生素的过度使用加剧了抗菌药物耐药性，因此亟需一种有效的预防和控制方法，例如针对溶藻弧菌的疫苗。在本研究
由溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）引起的弧菌病是尖吻鲈（Lates calcarifer）养殖中的主要细菌性疾病，并导致重大的经济损失。抗生素的过度使用加剧了抗菌药物耐药性，因此亟需一种有效的预防和控制方法，例如针对溶藻弧菌的疫苗。在本研究中，研究人员开发并评估了重组甘油醛-3-磷酸脱氢酶（rGAPDH）亚单位疫苗的不同配方在尖吻鲈中对溶藻弧菌的保护效力。将溶藻弧菌的GAPDH基因在ClearColi BL21(DE3)大肠杆菌（Escherichia coli）细胞中表达，并纯化得到37 kDa的rGAPDH蛋白。V1至V4组的鱼经腹腔注射免疫纯化的37 kDa rGAPDH蛋白制剂，分别为：不含Algel的5 μg rGAPDH（V1）、含Algel的5 μg rGAPDH（V2）、不含Algel的10 μg rGAPDH（V3）以及含Algel的10 μg rGAPDH（V4）。与对照组相比，免疫后的鱼表现出显著增强的免疫反应。含10 μg抗原的佐剂配方在免疫后第14天诱导了最高的血清凝集效价，并持续至第21天，同时展现出最强的血清溶菌酶活性和杀菌活性。对补体因子H、胱抑素B、HSP70和HSP90α的表达分析揭示了疫苗接种后组织特异性和时间依赖性的转录变化，不同疫苗配方呈现出不同的应答模式。在随后的溶藻弧菌攻毒实验中，V4组实现了100%的相对保护率（RPS），而V1、V2和V3组分别提供了39.47%、63.16%和63.16%的RPS。这些发现表明，在所测试的实验条件下，含有氢氧化铝佐剂的10 μg rGAPDH配方在实验性溶藻弧菌攻毒后赋予了完全的相对保护。所开发的37 kDa rGAPDH疫苗有望成为预防尖吻鲈养殖中弧菌病的一种有效候选疫苗。
研究背景与目的
由溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）引起的弧菌病是尖吻鲈（Lates calcarifer）养殖业中造成重大经济损失的主要细菌性疾病。传统上，该病的防控严重依赖广谱抗生素，但这导致了抗生素耐药菌株的扩散、水环境污染以及鱼肉组织中抗生素残留等问题，对公共健康构成威胁。因此，迫切需要寻找更安全的替代方案，如疫苗接种。在众多疫苗技术中，重组亚单位疫苗因其良好的安全性和高特异性免疫应答而备受关注。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）是一种高度保守的多功能糖酵解酶，已被广泛验证为针对多种硬骨鱼类细菌感染的交叉保护性候选抗原。然而，此前尚无研究系统性地优化重组GAPDH亚单位疫苗的配方，并在经济价值极高的海水网箱养殖物种——尖吻鲈中评估其对溶藻弧菌的特异性保护效力。因此，本研究旨在填补这一空白，通过优化疫苗配方（包括抗原剂量和佐剂的使用），评估重组GAPDH（rGAPDH）疫苗在尖吻鲈中对溶藻弧菌的种特异性保护效果。研究目标包括：生产并纯化来自致病性溶藻弧菌菌株的全长rGAPDH蛋白；在两种抗原浓度下，配合或不配合氢氧化铝佐剂，优化疫苗配方；以及在实验性攻毒后评估保护效力和存活率。此外，研究还选取了四个免疫相关基因（补体因子H、胱抑素B、HSP70和HSP90α）进行表达分析，以提供关于宿主对疫苗接种应答的补充信息。
主要关键技术方法
研究人员使用了从印度ICAR-CMFRI实验室保存的致病性溶藻弧菌菌株CMFRI-JF260912。实验所用健康无特定病原体的尖吻鲈购自印度泰米尔纳德邦的拉吉夫·甘地水产养殖中心尖吻鲈孵化场。疫苗制备方面，将纯化的rGAPDH蛋白与氢氧化铝（Algel）佐剂乳化。实验设计了四种疫苗配方和一个佐剂对照组：不含Algel的5 μg rGAPDH（V1）、含Algel的5 μg rGAPDH（V2）、不含Algel的10 μg rGAPDH（V3）以及含Algel的10 μg rGAPDH（V4），对照组注射含1% Algel的无菌PBS。通过腹腔注射途径对鱼进行免疫。在免疫后第7、14和21天采集血液和组织样本用于后续分析。攻毒实验在免疫后第21天进行，通过腹腔注射致死剂量的溶藻弧菌，并监测30天内的死亡率。采用定量逆转录PCR（qRT-PCR）检测脾脏和头肾中四个免疫相关基因的mRNA表达水平，并以EF1α作为内参基因。所有统计分析均使用双因素方差分析和Tukey HSD检验。
研究结果
3.1 重组表达与纯化：成功扩增了溶藻弧菌的GAPDH基因（1002 bp），并在ClearColi BL21(DE3)中表达了约37 kDa的rGAPDH蛋白。纯化后的rGAPDH纯度达到92.4 ± 1.8%，最终产量约为每升培养物110 mg。
3.2 保护效力：攻毒后，未接种疫苗的PBS+Algel对照组累积死亡率为70.37%。V4组（10 μg rGAPDH + Algel）在30天观察期内无死亡，实现了100%的相对保护率（RPS）。V2组（5 μg rGAPDH + Algel）和V3组（10 μg rGAPDH）的累积死亡率均为25.93%，RPS同为63.16%。V1组（5 μg rGAPDH）的累积死亡率为42.59%，RPS为39.47%。
3.3 血清凝集抗体滴度：所有疫苗接种组的血清凝集抗体滴度均显著高于对照组。在免疫后第14天，V4组达到最高抗体滴度（5 log2），并维持至第21天。相比之下，其他组在14天后滴度有所下降。
3.4 血清杀菌活性：通过细菌存活百分比（BSP）评估血清杀菌活性，数值越低表示活性越强。所有疫苗接种组的BSP均显著低于对照组。在免疫后第14和21天，V4组显示出最低的BSP（分别为13.92%和8.31%），表明其血清杀菌活性最强。
3.5 血清溶菌酶活性：所有疫苗接种组的血清溶菌酶活性均显著高于对照组。V4组在整个实验期间均表现出最高的溶菌酶活性，并在第21天达到峰值（1077.4 U/mL）。
3.6 基因表达谱：
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补体因子H：在脾脏中，V4组在第21天表达量最高（log2倍变化为1.34）。在头肾中，V4组显示出从第7天到第21天的稳定渐进式上调。
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胱抑素B：在V3组的头肾中，第7天表达量达到峰值并持续升高至第21天。V4组则在脾脏和头肾中均表现为第14和21天的显著上调。
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HSP70和HSP90α：在V3和V4组的脾脏和头肾中，这两个基因均在免疫后期（第21天）显著上调，而在早期（第7天）则呈现组织差异性表达（如在V3和V4组的脾脏中下调，但在头肾中上调）。
讨论与结论
本研究表明，含10 μg rGAPDH和氢氧化铝佐剂的配方在实验条件下为尖吻鲈提供了100%的相对保护率，这是迄今报道的重组弧菌疫苗在硬骨鱼中获得的最高保护水平之一。研究证实，佐剂的使用能显著提升保护效力，这与氢氧化铝作为储存库佐剂延长抗原暴露时间和增强体液免疫应答的作用相符。血清学分析显示，V4组诱导了最强且持久的抗体应答、杀菌活性和溶菌酶活性。基因表达分析揭示了疫苗接种后复杂的免疫调节机制，包括补体调控、蛋白酶抑制和应激反应等通路的参与。特别是V4组中补体因子H的持续诱导，可能有助于平衡补体激活与防止组织损伤，从而在实现高效杀菌的同时确保安全性。该研究的结论是：首次证明了由10 μg抗原和氢氧化铝佐剂配制的37 kDa rGAPDH亚单位疫苗，在实验条件下对溶藻弧菌攻毒的尖吻鲈实现了100%的相对保护率。疫苗接种引发了显著的免疫应答，包括血清凝集滴度、杀菌活性和溶菌酶活性的提升。此外，接种鱼体内补体因子H、胱抑素B、HSP70和HSP90α基因的组织特异性和时间依赖性调控，为rGAPDH疫苗接种后免疫相关通路的改变提供了分子证据。这些结果表明，疫苗接种可能影响多个免疫相关过程，包括补体调控、蛋白酶抑制、细胞应激反应和免疫信号传导。总体而言，这些结果支持了rGAPDH作为尖吻鲈抗溶藻弧菌保护性疫苗抗原的潜力。在佐剂配方中观察到的更高RPS进一步表明，在评估的实验条件下，氢氧化铝可能增强了疫苗效力。未来的研究需评估保护性免疫的持续时间、对不同弧菌种类和菌株的交叉保护潜力，以及在商业化养殖条件下的有效性。这项研究为进一步开发抗溶藻弧菌的重组亚单位疫苗奠定了基础，有望改善鱼类健康、支持可持续海水养殖，并减少疾病管理中对抗生素的依赖。
