CST1在ERα阳性乳腺癌中富集表达并与ECM/CAF相关转录组特征关联

《Cancer Management and Research》：CST1 Expression is Enriched in ERalpha-Positive Breast Cancer and Associated with ECM/CAF-Related Transcriptomic Features

　　

背景：CST1已被实验证实与乳腺癌中的雌激素受体α（ERalpha）信号通路相关，但临床组织样本与公共队列证据尚未得到完整整合。本研究旨在探讨CST1是否在ERalpha阳性肿瘤中富集表达，以及其表达是否与管腔型（luminal）及肿瘤微环境特征相关。 方法：研究人员对179例去重后的独特乳腺癌标本进行CST1免疫组织化学（IHC）分析，其中包括135例分布于四个预设ERalpha百分比分层中的ERalpha阳性病例，以及44例互斥的ERalpha阴性、三阴性或HER2过表达对照组。外部验证采用TCGA-BRCA、METABRIC和CPTAC-BRCA队列。TCGA数据用于差异表达、共表达、通路富集及精选模块评分分析。 结果：CST1阳性率在ERalpha阳性肿瘤中显著高于对照组（101/135，74.8% vs 11/44，25.0%；比值比[OR] 8.91，95%置信区间[CI] 4.06–19.54），且ERalpha阳性组的CST1 H评分更高。公共队列证实ER阳性肿瘤中CST1 mRNA表达更高，并存在显著的PAM50亚型差异。机构IHC显示对ERalpha阳性状态的区分度为中等水平（曲线下面积[AUC] 0.789），而转录组水平的AUC在TCGA-BRCA（0.596）、METABRIC（0.562）和CPTAC-BRCA（0.693）中较为有限。在TCGA-BRCA中，CST1高表达肿瘤表现出ECM/CAF相关的共表达、通路富集及模块评分模式。在CPTAC-BRCA中，CST1与ESTIMATE和xCell来源的基质富集评分相关。由于ER状态、PAM50亚型和肿瘤纯度可能混淆CST1表达与基质评估之间的关系，这些探索性组织块关联应在肿瘤亚型和组织构成的背景下进行解读。 结论：CST1蛋白水平在ERalpha阳性乳腺癌中富集表达，并在多个公共队列中可重复地与ER/管腔特征相关。探索性计算分析进一步将CST1与ECM/CAF相关转录组及基质富集特征相关联。然而，ER状态、PAM50亚型和肿瘤纯度的潜在混杂效应，以及缺乏空间或功能验证，排除了对基质关联进行独立或因果解释的可能性。

一、研究背景与科学问题

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，也是癌症死亡的主要原因之一。雌激素受体α（ERalpha）是乳腺癌中最具临床意义的生物标志物之一，它决定内分泌治疗敏感性、参与分子亚型划分并指导常规治疗决策。然而，临床实践中以免疫组织化学（IHC）检测的ERalpha百分比是一种简化的临床读数，无法完全反映ERalpha阳性肿瘤内部的生物学异质性。ERalpha阳性肿瘤在管腔分化程度、基质组成、免疫背景和治疗反应性方面存在显著差异。因此，能够反映更广泛上皮和微环境状态的ERalpha相关蛋白可能提供超越二元ER状态的额外转化信息。

CST1编码半胱氨酸蛋白酶抑制剂SN（cystatin SN），是一种最初在分泌性上皮细胞中发现的分泌型半胱氨酸蛋白酶抑制剂，越来越多的证据表明其参与肿瘤进展。在多种恶性肿瘤中，CST1与侵袭、细胞外基质重塑和侵袭性生物学行为相关。在乳腺癌中，既往实验研究已表明CST1通过ERalpha/PI3K/AKT/ERalpha回环通路促进增殖。这一机制性观察提出了重要的临床问题：CST1在人乳腺癌组织中的表达是否在ERalpha阳性疾病中富集，以及CST1是否标记了超越ERalpha本身的更广泛生物学状态。

该问题的临床相关性在于，分泌型或细胞外相关标志物可能捕获ESR1转录或ERalpha百分比无法完全代表的生物学信息。乳腺癌相关成纤维细胞（CAF）本身具有异质性，并与不同的基质和免疫环境相关联。因此，组织块转录组关联无法确定CST1的细胞来源或建立直接的基质功能。一个具有临床信息价值的ER相关生物标志物不必与ERalpha百分比呈线性关系，而可能识别一种倾向于与ERalpha阳性疾病共存的管腔上皮背景、分泌表型或基质相关程序。

基于上述背景，本研究采用分层转化分析策略：首先在机构IHC队列中评估CST1蛋白阳性和半定量H评分；其次在TCGA-BRCA、METABRIC和CPTAC-BRCA中进行转录组验证；第三，检验CST1与经典管腔基因及免疫相关模块的跨队列关联；第四，利用TCGA全转录组数据定义CST1高表达肿瘤、共表达结构、通路富集和肿瘤生态系统模块关联；最后，利用CPTAC-BRCA临床注释通过ESTIMATE和xCell指标独立验证基质和免疫背景信号。

研究的工作假设并非CST1必须随ERalpha百分比的每次增加而单调上升，而是CST1在ERalpha阳性/管腔型乳腺癌中富集，并可能与更广泛的ECM/CAF相关基质表型和次要免疫标志物关联相关。

二、主要关键技术方法

本研究采用多队列、多层次的分析框架。机构IHC队列回顾性筛选了2023年1月12日至2025年12月26日期间的存档病理记录和乳腺癌标本，排除缺失或不可解释数据及重复病理标识后，最终纳入179例独特肿瘤，包括135例ERalpha阳性病例和44例互斥对照组。CST1阳性定义为染色百分比非零且强度非零，H评分按染色百分比乘以强度评分（0–3）计算。公共转录组队列方面，TCGA-BRCA RNA-seq数据通过UCSC Xena获取，METABRIC和CPTAC-BRCA数据通过cBioPortal获取。TCGA数据用于差异表达分析（CST1高表达与低表达四分位组比较）、全基因组Spearman共表达分析，以及将前300个正共表达基因提交至Enrichr进行GO Biological Process 2023和KEGG 2021 Human通路过表达分析。预设模块评分以标记基因的平均z分数计算，涵盖ER/管腔、管腔上皮、基底/EMT、CAF/基质、内皮、IFN炎症、细胞毒性T/NK、检查点、髓系/巨噬细胞、B细胞和热休克程序。CPTAC-BRCA中检验CST1与ESTIMATE基质评分、ESTIMATE免疫评分、ESTIMATE肿瘤纯度、xCell基质富集评分、xCell免疫富集评分、CIBERSORT绝对评分和干性评分的相关性。统计分析采用Fisher精确检验、Mann–Whitney U检验、Kruskal–Wallis检验和Spearman相关分析，多重比较采用Benjamini-Hochberg FDR校正。

三、研究结果

CST1蛋白表达在机构IHC队列的ERalpha阳性乳腺癌中富集

机构IHC提供了CST1蛋白在ERalpha阳性乳腺癌中富集的主要组织水平证据。CST1阳性率在ERalpha阳性肿瘤中显著高于合并对照组（101/135，74.8% vs 11/44，25.0%；Fisher p=6.19e-09），比值比为8.91（95% CI 4.06–19.54）。CST1 H评分在ERalpha阳性组中显著更高（中位数1.00，IQR 0.25–30.00 vs 中位数0.00，IQR 0.00–0.13；Mann–Whitney p=3.21e-09）。预设对照比较中，ERalpha阳性肿瘤较ERalpha阴性/三阴性对照（OR 16.34，95% CI 5.26–50.78）和HER2过表达对照（OR 4.67，95% CI 1.68–13.00）更可能为CST1阳性。ERalpha分层分析显示富集伴随异质性：CST1阳性率在ERalpha 1–30%为80.8%，ERalpha 50–70%为100.0%，ERalpha 80%为64.7%，ERalpha 90–100%为70.1%；而ERalpha阴性为0.0%，三阴性为16.7%，HER2过表达为38.9%。数据不支持CST1阳性率与ERalpha百分比呈严格单调关系，而表明CST1在ERalpha阳性谱系中频繁表达但内部存在异质性。

公共转录组队列验证CST1在ER阳性和管腔型乳腺癌中的富集

三个外部转录组队列独立验证了这一模式。TCGA-BRCA中ER阳性肿瘤CST1表达高于ER阴性肿瘤（中位数7.555 vs 6.258；p=6.15e-06），METABRIC（中位数7.613 vs 7.141；p=4.16e-05）和CPTAC-BRCA（中位数3.743 vs 2.051；p=9.394e-04）方向一致，且均通过FDR校正。CST1在三个队列的分子亚型间均存在显著差异（TCGA-BRCA p=3.10e-08，METABRIC p=1.47e-11，CPTAC-BRCA p=1.660e-04），预设配对比较显示LumA/LumB肿瘤的CST1表达一致高于Basal肿瘤。

跨队列相关分析将CST1与管腔转录程序相关联

在METABRIC中，CST1与GATA3（rho=0.122）、FOXA1（rho=0.100）、ESR1（rho=0.097）、PGR（rho=0.079）及ER/管腔模块（rho=0.074）正相关。TCGA-BRCA中ESR1、PGR、FOXA1、GATA3和ER/管腔模块方向一致，并额外观察到与免疫炎症、检查点和髓系/巨噬细胞模块的正相关。

ROC分析总结机构及公共队列中ERalpha阳性状态的区分度

机构IHC H评分的AUC为0.789（95% CI 0.716–0.854），mRNA水平AUC在TCGA-BRCA、METABRIC和CPTAC-BRCA中分别为0.596、0.562和0.693，表明CST1单独作为组织块转录组数据分类器的性能有限。

TCGA共表达和通路分析识别CST1相关的ECM/CAF转录组关联

TCGA中CST1高表达肿瘤的差异表达基因包括CST1、CST4、HTRA3、CST2、COL10A1、NOX4、C20orf103和SFRP2等。正共表达基因富集于细胞外基质组织、细胞外结构组织、外部封装结构组织、胶原纤维组织、细胞-基质黏附和细胞迁移调控等通路，上皮-间质转化（EMT）为最强富集项（校正p=9.47e-36）。模块分析显示CST1高表达肿瘤中CAF/基质、髓系/巨噬细胞、IFN炎症、检查点、ER/管腔和管腔上皮评分较高。标志物水平上，CST1与COL10A1、SFRP2、MMP11、FAP、COL1A2和COL1A1等CAF/ECM标志物正相关。

CPTAC分析识别CST1与基质富集评分的关联

在CPTAC-BRCA中，CST1与ESTIMATE基质评分正相关（rho=0.352，FDR=7.11e-04）和xCell基质富集评分正相关（rho=0.306，FDR=0.003），与肿瘤纯度和干性负相关；CIBERSORT绝对评分、ESTIMATE免疫评分和xCell免疫评分经FDR校正后不显著。METABRIC中的探索性生存分析未显示CST1的显著预后效应。

四、讨论与结论

综合研究支持CST1作为ERalpha阳性乳腺癌的特征标志物。机构IHC数据是研究的核心锚点，直接评估了人乳腺癌组织中的CST1蛋白，阳性和H评分均显示富集，并在多种互斥对照比较中保持一致。ERalpha分层数据未显示单调剂量-反应模式，CST1应被解读为ERalpha阳性/管腔富集标志物，而非ERalpha百分比的线性替代指标。转录组分析提供了独立但较温和的证据层面，三个公共队列均显示ER阳性肿瘤中CST1表达更高，亚型分析一致地将CST1与管腔型而非基底型疾病相关联。IHC AUC较强而mRNA AUC有限，表明空间评估的蛋白染色能更清晰地区分机构分组，而组织块RNA测量平均了混合细胞群体的信号。

ECM/CAF相关关联是研究的探索性延伸。CST1高表达肿瘤优先表达基质相关基因，共表达网络富集于细胞外基质过程，CAF/基质模块显示最大的未校正差异。然而，ER状态和PAM50亚型与管腔分化密切相关，也可能与基质组成相关，CST1表达组间ER阳性和管腔肿瘤比例的差异可能部分解释观察到的CAF/基质信号。肿瘤纯度是另一关注点，因为基于组织块表达数据的基质富集评分随非肿瘤成分相对比例增加而升高。这些相互关联的因素在回顾性组织块数据集中无法完全区分，结果应被解读为产生假说的关联，而非独立或因果效应。

研究的优势在于证据的分层一致性：机构IHC确立蛋白水平关联，公共转录组队列重现ER阳性和管腔富集信号，跨队列相关分析将CST1置于管腔转录框架内，TCGA挖掘识别ECM/CAF相关共表达和模块模式，CPTAC提供基质富集关联的独立分析。阴性探索性生存分析的保留提高了透明度并降低了选择性报告风险。

研究局限性包括：公共数据集捕获组织块mRNA而非空间分辨的CST1蛋白定位；ER状态、PAM50亚型和肿瘤纯度均与乳腺癌转录和基质特征相关，构成潜在混杂因素，且未进行联合建模；机构H评分由半定量病理记录重建而非集中式数字图像分析；对照组亚组规模不均；预设ERalpha分层基于存档采样框架而非穷尽连续类别；代表性病理图像为定性而非推断性。

结论：机构IHC队列和三个公共乳腺癌队列的综合分析表明，CST1表达在ERalpha阳性乳腺癌中富集，并与ER/管腔特征可重复关联。探索性组织块转录组分析还识别了CST1表达与ECM/CAF相关基因表达模式和基质富集评分的关联。然而，ER状态、PAM50亚型和肿瘤纯度的潜在混杂效应，以及缺乏空间或功能验证，排除了这些关联具有独立性或CST1直接调控基质重塑的结论。CST1应被视为与ECM/CAF相关转录组背景关联的ERalpha相关候选标志物，需在空间分辨和前瞻性设计的研究中进一步验证。