GYPC甲基化与p16/Ki67免疫组化染色在宫颈上皮内瘤变中的异质性：对风险分层的意义

《Cancer Management and Research》：Heterogeneity of GYPC Methylation and p16/Ki67 Immunostaining in Cervical Intraepithelial Neoplasia: Implications for Risk Stratification

　　

背景：GYPC甲基化（GYPCm）是癌变过程中的早期事件，而p16和Ki67是宫颈病变病理学中的关键标志物。本研究旨在探讨宫颈病变中GYPCm状态与免疫组化标志物p16、Ki67及其联合免疫组化评分（IS）之间的关系。 方法：研究人员对2022年10月至2023年7月期间收集的203例经组织学确诊的宫颈病变标本进行了回顾性分析。这些标本包括79例宫颈上皮内瘤变（CIN）1级（CIN1）（38.9%）、48例CIN2（23.6%）、66例CIN3（32.5%）和10例宫颈鳞状细胞癌（SCC；4.9%）。研究人员进行了p16和Ki67的免疫组化染色以及GYPCm检测，并评估了GYPCm与IS之间的关联。 结果：随着宫颈病变严重程度的增加，GYPCm的ΔCp值显著降低（Cuzick趋势检验，P < 0.001）。p16、Ki67和IS均随宫颈病变严重程度的增加呈上升趋势（所有P趋势 < 0.001）。此外，GYPCm水平随p16、Ki67和IS的增加而升高（所有P趋势 < 0.001）。在所有SCC病例中均观察到IS为5–6和高GYPCm。在CIN中存在GYPCm和IS的异质性：在CIN1中，有15例患者的IS为3–4且伴有中度或高GYPCm。在CIN2中，有7例患者的IS为3–4且伴有低GYPCm。 结论：在CIN中，IS和GYPCm存在显著的异质性。这些发现表明，GYPCm联合p16/Ki67免疫组化染色可能有助于宫颈病变的风险分层。然而，由于这是一项无纵向随访的回顾性横断面研究，这些标志物在预测短期癌症进展方面的价值需要前瞻性验证，之后才能用于指导个体化管理。

论文解读文章

一、研究背景与研究目的

宫颈癌是全球最常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在许多国家仍居高不下。DNA甲基化作为基因表达调控的重要机制，在宫颈癌的发生发展中扮演关键角色。异常的基因甲基化可导致细胞周期调控、DNA修复、凋亡等相关基因的表达失调，从而促进宫颈肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。已有研究表明，特定基因的甲基化可作为宫颈癌早期诊断的潜在生物标志物。

GYPC基因编码人类红细胞膜糖蛋白C（glycophorin C），既往研究发现其在急性淋巴细胞白血病中低表达提示预后不良，在卵巢癌患者血浆中观察到显著的甲基化折叠变化，并且可作为子宫内膜癌早期诊断的生物标志物。在HR-HPV阳性女性中，高GYPC^m组进展至CIN3及以上病变的风险比约为低甲基化组的23倍，表明GYPC基因甲基化与宫颈上皮内瘤变的严重程度显著相关。

p16和Ki67在宫颈病变病理学中发挥重要作用。p16蛋白由抑癌基因CDKN2A编码，在HPV诱导的宫颈病变中，其过表达是致癌E7蛋白活性的替代标志物。Ki67是一种核蛋白，是细胞增殖的可靠标志物。联合p16/Ki67检测广泛用于宫颈病变的筛查和诊断。

目前存在的主要问题是：临床上区分生物学上异质性的CIN2病变至关重要，因为部分CIN2病变可自发消退，而另一些则进展为CIN3或癌症。基于HPV的风险分层无法完全捕捉这种异质性。因此，反映宿主细胞转化的生物标志物（如GYPC^m）可能补充现有的临床参数。此前关于p16/Ki67免疫组化评分（IS）与PAX1/ZNF582甲基化关系的研究已有报道，但GYPC^m状态与IS在宫颈病变中的关系尚不清楚。本研究旨在探讨GYPC^m状态与p16、Ki67及IS在宫颈病变中的关系，为CIN的预防和治疗提供新思路和方法。

二、关键技术方法

1. 1.
   研究设计与样本来源：回顾性研究，纳入2022年10月至2023年7月在长沙市中心医院经组织病理学确诊的宫颈病变患者（CIN1、CIN2、CIN3及SCC），共203例。纳入标准包括HR-HPV阳性、三个月内行阴道镜活检并签署知情同意书。排除有癌症病史、曾接受CIN或癌症治疗、免疫功能低下及有HPV疫苗接种史者。
2. 2.
   GYPC^m检测：采用亚硫酸氢盐转化预处理，以COL2A1作为内参基因验证转化效率。使用定量甲基化特异性PCR（qMSP）检测GYPC^m状态，计算ΔCp值（Cp(GYPC) – Cp(COL2A1)），ΔCp越低表示甲基化水平越高。根据约登指数最大化原则确定cut-off值：ΔCp ≤ 8.19为高甲基化，8.19 < ΔCp ≤ 15为中甲基化，ΔCp > 15为低甲基化。
3. 3.
   p16、Ki67及IS评估：由两名病理学家在不了解临床信息和GYPC^m结果的情况下进行免疫组化染色和评分。p16和Ki67分别按0-3分评分，IS范围为0-6分，分为三组：5-6分（高IS，与CIN3相关）、3-4分（中IS，与CIN2相关）、0-2分（低IS，与CIN1相关）。
4. 4.
   统计分析：使用R软件（版本4.3.2），连续变量以中位数（IQR）表示，分类变量以计数（%）表示。采用Cuzick趋势检验分析连续变量与有序分类变量间的趋势，使用DescTools和multitiCA包分析两个有序分类变量间的趋势。使用pROC包绘制ROC曲线评估GYPC^m鉴别CIN3+与< CIN3的性能。

三、研究结果

患者临床病理特征：共纳入203例患者，其中CIN1 79例（38.9%）、CIN2 48例（23.6%）、CIN3 66例（32.5%）、SCC 10例（4.9%）。患者中位年龄40.0岁，GYPC^m中位ΔCp值为10.1。

GYPC^m状态与宫颈病变严重程度的关系：GYPC^m的ΔCp值随宫颈病变严重程度增加而显著下降（P < 0.001）。不同病变类型间ΔCp值差异均有统计学意义（Bonferroni校正后P < 0.05）。宫颈病变严重程度（CIN1、CIN2、CIN3、SCC）与GYPC^m呈正相关趋势（P_趋势 < 0.001）。GYPC^m检测CIN3+病变的ROC曲线下面积为0.783（95%CI 0.719–0.848）。所有SCC患者均为高GYPC^m。

p16、Ki67、IS与宫颈病变及GYPC^m的关联：宫颈病变严重程度与p16、Ki67及IS评分均呈趋势相关性（所有P_趋势 < 0.001）。所有宫颈癌患者的p16和Ki67评分均为3分，IS均为6分。IS为3-4分组与5-6分组间GYPC^m的ΔCp值差异有统计学意义（P < 0.001）。GYPC^m程度随p16、Ki67和IS评分的升高而增加（所有P < 0.001）。在p16和Ki67评分为3的患者中，高GYPC^m的比例分别为57.7%和80.3%。在IS为6的患者中，高GYPC^m占79.6%。

宫颈病变中GYPC^m和IS的异质性：在CIN中观察到GYPC^m和IS的异质性。在27例IS为5-6的CIN2患者中，有13例低GYPC^m、5例中GYPC^m和9例高GYPC^m。在58例IS为5-6的CIN3患者中，有11例低GYPC^m、4例中GYPC^m和43例高GYPC^m。所有10例SCC患者均为IS 6分且高GYPC^m。在41例IS为0-2的CIN1患者中，GYPC^m低、中、高分别为28例、3例和10例。

四、讨论与结论总结

讨论部分总结：DNA甲基化水平在宫颈癌组织中普遍较高，且与宫颈病变严重程度密切相关。CIN的生物学行为存在异质性，相同级别的CIN可能表现出不同的细胞标志物表达模式。p16的异质性表达可能反映病变区域内细胞的不同增殖能力和转化潜能，与CIN2病变的进展和消退率密切相关。Ki67阳性细胞比例在不同病例间可能存在差异，反映了癌前病变中细胞增殖活性的异质性。本研究发现GYPC^m ΔCp值随宫颈病变严重程度和IS的增加而降低，所有宫颈癌病例均可检出GYPC^m。GYPC^m阳性率随p16、Ki67和IS评分的增加而升高。对于CIN1中IS为3-4且GYPC高甲基化或中甲基化的15例患者以及IS为5-6的2例患者，这些分子异质性病例可能在未来的前瞻性研究中代表需要更密切监测的亚群。研究中1例CIN2患者IS为0-2且GYPC^m阴性，提示低级别风险，建议延迟治疗以保护育龄期患者的生育功能。但本研究缺乏纵向随访，不能仅凭这些发现做出临床管理建议。CIN的进展或消退还与其他临床因素相关，如细胞学异常严重程度和HR-HPV E6/E7整合情况等。GYPC^m与p16/Ki67双染及病变严重程度之间的强相关性强调了这一观点。研究局限性包括：回顾性设计、缺乏前瞻性随访、样本量有限、未进行HR-HPV特异性基因分型等。准确的预后生物标志物可识别高风险CIN患者，有望改善未来的宫颈癌筛查方案。

研究结论翻译：总之，GYPC^m、p16、Ki67和IS与宫颈病变严重程度相关。在CIN病例中观察到GYPC^m和IS存在相当大的异质性。这些标志物可能具有风险分层的潜在价值；但由于这是一项无纵向随访的回顾性横断面研究，它们预测短期癌症进展的能力尚未得到证实。在将这些发现用于指导临床管理之前，需要进行前瞻性纵向研究。