WTAP介导的m6A甲基化可稳定pIgR mRNA，并减轻烟雾诱导的上皮炎症和凋亡

《iScience》：WTAP-mediated m6A methylation stabilizes pIgR mRNA and attenuates smoke-induced epithelial inflammation and apoptosis

　　

亮点
•烟雾吸入性损伤下调 WTAP 并减少肺部 m6A 甲基化
•WTAP 敲低减弱烟雾诱导的上皮炎症和凋亡
•WTAP 介导 pIgR mRNA 756/772 区域内的 m6A 甲基化
•WTAP/m6A/pIgR 轴是烟雾吸入性损伤（SII）早期干预的候选靶点

摘要
烟雾吸入性损伤（SII）显著提高了烧伤患者的死亡率。尽管 N6-甲基腺苷（m6A）甲基化作为肺部炎症和损伤的核心表观转录组调节因子日益凸显，但其在 SII 中的具体作用仍不明确。利用体内小鼠 SII 模型和烟雾提取物处理的 MLE-12 细胞，我们表明烟雾暴露下调了 m6A 写作复合物组分 WTAP 并减少了全局 m6A 甲基化。WTAP 敲低减弱了上皮炎症、凋亡和 STAT3 激活。整合转录组学与加权基因共表达网络分析（WGCNA）及 MeRIP-qPCR，我们确定 pIgR 为下游靶点：WTAP 修饰 pIgR mRNA 756/772 区域内的 m6A 甲基化，其敲低延长了 pIgR mRNA 半衰期并升高 pIgR 表达。pIgR 沉默逆转了 WTAP 敲低带来的保护作用。这些发现定义了一个 WTAP/m6A/pIgR 轴，该轴塑造了对烟雾吸入的早期上皮反应，并确定 WTAP 为 SII 的候选治疗靶点。

图形摘要
引言
烟雾吸入性损伤（SII）是火灾相关事件中的主要死因之一，且常伴随严重的烧伤创伤。尽管热损伤主要影响上气道，但烟雾中含有 一氧化碳、氰化物和大量毒性颗粒（直径小于 1 微米），这些物质可深入穿透至下呼吸道。这些成分破坏肺泡上皮和血管内皮细胞，破坏肺泡毛细血管屏障，并增加微血管通透性，导致富含蛋白质的液体泄漏到肺泡空间。上皮屏障的破坏触发了快速的先天免疫反应，驱动肺泡巨噬细胞和中性粒细胞的募集，并导致强烈的炎症细胞因子风暴（如 TNF-α、IL-1β 和 IL-6）。此炎症级联反应的放大可导致急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、不可逆呼吸衰竭和 multi-organ 功能障碍，而后期可能出现免疫紊乱甚至免疫抑制。尽管气道管理、液体复苏和支持治疗取得了进展，但上皮对烟雾吸入反应的具体机制仍知之甚少。

最近，转录后调控，特别是 N6-甲基腺苷（m6A），已成为真核生物 mRNA 中最丰富的内部转录后修饰。它在调节 mRNA 稳定性、剪接、核输出和翻译效率方面也发挥着重要作用。这种特定的 RNA 甲基化影响 T 细胞分化、巨噬细胞极化和先天免疫机制。该修饰由多组分甲基转移酶复合物（MTC）催化，其中 WTAP（Wilms 肿瘤 1 关联蛋白）是核心甲基转移酶组的关键部分。它招募甲基转移酶 METTL3 和 METTL14 至核斑，并确保精确的位点特异性甲基化。既往研究表明，WTAP 通过调节 T 细胞分化和细胞死亡信号通路，在炎症和免疫疾病中发挥重要作用。此外，据报道颗粒物暴露可改变肺上皮细胞中的全局 m6A 水平。越来越多的证据表明，m6A 甲基化在炎症和免疫反应中发挥重要作用。然而，WTAP 介导的 m6A 修饰如何参与急性烟雾吸入损伤仍不清楚。

多聚免疫球蛋白受体（pIgR）是黏膜上皮细胞表面的跨膜蛋白。其主要功能是运输二聚体 IgA（dIgA）穿过上皮细胞并在黏膜表面形成分泌型 IgA（sIgA），从而介导免疫隔离并防止病原体粘附。sIgA 广泛分布于包括呼吸道和胃肠道在内的黏膜组织。呼吸道黏膜是黏膜免疫系统的关键组成部分。除了运输功能外，pIgR 也被认为是维持免疫稳态的重要因素。pIgR 缺陷小鼠表现出气道中性粒细胞浸润增强和黏膜免疫稳态紊乱。

在本研究中，我们发现烟雾吸入后全局 m6A 水平和甲基转移酶 WTAP 显著降低。由于 WTAP 敲低进一步减弱了烟雾诱导的上皮炎症和凋亡，我们假设 WTAP 下调可能代表一种针对急性烟雾压力的内源性调节途径。然后我们将 pIgR 鉴定为 WTAP 介导的 m6A 甲基化的下游靶点。WTAP 敲低降低了 pIgR mRNA 上的 m6A 甲基化，增强了其稳定性并增加了 pIgR 表达。这些发现表明，WTAP/m6A/pIgR 轴可能参与烟雾吸入损伤的上皮反应，并限制早期肺部炎症和上皮凋亡。

结果
烟雾暴露导致肺部炎症和凋亡
为了模拟真实火灾场景的复杂暴露条件，我们设计了一种由燃烧室和动物室组成的烟雾发生器（图 1A 和 1B）。鉴于常见的室内火灾材料包括木材、纸张和塑料，而森林火灾主要涉及植物燃烧，我们选择了具有成本效益且易获得的松木锯末作为燃料。其他研究使用了松树皮燃烧或杨木阴燃。我们的设备通过手动将烟雾泵入动物室提供了精确控制。气体成分分析显示动物室在 0、1、3 和 5 分钟时的浓度：氧气水平下降，而二氧化碳、一氧化碳和二氧化硫浓度呈时间依赖性增加（图 1C）。该设备成功复制了火灾环境的低氧和有毒环境。

图 1 烟雾吸入破坏肺泡毛细血管屏障并在体内引发剧烈肺部炎症
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(A–C) 用于烟雾吸入暴露的手工烟雾发生器示意图和照片；(C) 烟雾暴露期间气体成分动态的实时监测，包括 O2 (%)、CO2 (%)、CO (ppm) 和 SO2 (ppm)。
(D) 对照组和 SII 小鼠肺组织的代表性苏木精 - 伊红（H&E）染色（比例尺：100 μm）。
(E–J) BALF 中的蛋白浓度；(F) Bcl-2 的 RT-qPCR 分析；(G) TNF-α 和 IL-1β 的 RT-qPCR 分析；(H) TNF-α 和 IL-1β 表达的免疫印迹检测；(I) Bcl-2 表达的免疫印迹检测；(J) STAT3 和 p-STAT3 表达的免疫印迹检测。SII 模型：n = 5，n 代表个体小鼠数量；(D) 每只动物显示一个代表性切片；(H–J) 每组 n = 5 只小鼠，2 次独立重复；数据以均值 ± 标准差表示；两组比较采用双尾 Student's t 检验分析，多组比较采用单因素方差分析及 Tukey 事后检验。ns，不显著；?p < 0.05；??p < 0.01。

烟雾破坏了肺泡毛细血管屏障，这通过损伤后 24 和 48 小时支气管肺泡灌洗液（BALF）中总蛋白浓度升高得到证实（图 1E）。图 1D 显示肺泡空间内有大量炎症细胞浸润、红细胞渗出和蛋白质碎屑沉积（箭头所示）。尽管某些区域有终末细支气管扩张，但气管壁结构相对完整。这可能反映了急性损伤的特征，而气道壁增厚更常见于慢性重塑，因此在早期阶段（24–48 小时）并不明显。同时，促炎细胞因子（TNF-α 和 IL-1β）的表达激增（图 1G 和 1H）。RT-qPCR 分析显示抗凋亡蛋白 Bcl-2 显著减少（图 1F）。

接下来，我们用烟雾提取物（SE）处理 MLE-12 细胞。CCK-8（图 2C）和划痕实验（图 2A 和 2B）显示细胞活性和迁移能力呈剂量和时间依赖性下降。炎症细胞因子和抗凋亡蛋白表现出与体内一致的变化，证据是 TNF-α 和 IL-1β 增加（图 2D 和 2H），而 Bcl-2 水平降低（图 2E 和 2G）。流式细胞术进一步确认 SE 暴露后上皮凋亡显著增加（图 2F）。

图 2 烟雾提取物在体外损害肺上皮活力并驱动炎症和凋亡信号
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(A–H) 评估烟雾提取物（SE）暴露后 MLE-12 上皮细胞迁移能力的划痕实验；(C) CCK-8 测定法检测烟雾暴露后的细胞活力；(D) TNF-α 和 IL-1β 的 RT-qPCR 分析；(E) Bcl-2 的 RT-qPCR 分析；(F) 量化暴露后上皮凋亡率的流式细胞术分析；(G) Bcl-2 表达的免疫印迹检测；(H) STAT3、p-STAT3 和 IL-1β 表达的免疫印迹检测。n = 3 次独立生物学重复，来自 3 次独立重复。对于所有体外图像，n 代表独立生物学重复的数量。数据以均值 ± 标准差表示；两组比较采用双尾 Student's t 检验，多组比较采用单因素方差分析及 Tukey 事后检验??。ns 表示无显著差异，?p < 0.05，??p < 0.01。

总之，这些数据确认烟雾暴露诱导了由肺部炎症和凋亡驱动的严重上皮损伤。

烟雾暴露降低全局 m6A 水平和 WTAP 表达
为了调查烟雾暴露诱导的转录后变化，我们首先检测了全局 m6A 甲基化水平。比色定量显示体内和体外均有显著降低（图 3A）。既往研究发现暴露于环境颗粒物的肺上皮细胞中的全局 m6A 甲基化水平也显示出类似的下降。此外，据报道过敏性哮喘模型中的 m6A 甲基化水平也降低。

图 3 烟雾暴露降低全局 m6A 甲基化和 WTAP 表达，且 WTAP 敲低减弱 SE 诱导的上皮炎症和凋亡
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(A) 体内和体外整体 m6A RNA 甲基化水平的比色定量；(B–D) WTAP 在体内和体外 mRNA 和蛋白水平的表达。
(E–M) 通过慢病毒转导验证 MLE-12 细胞中稳定的 WTAP 敲低效率；WTAP 敲低后 TNF-α 和 IL-1β 的 RT-qPCR (H) 和免疫印迹 (I) 分析；WTAP 敲低后 STAT3、p-STAT3 表达的免疫印迹检测 (J)；WTAP 敲低后 Bcl-2 的 mRNA (G) 和蛋白 (K 和 M) 表达；(L) 流式细胞术评估暴露于 SE 的 WTAP 敲低细胞的凋亡。n = 3 次独立生物学重复和 3 次独立重复。对于体内图像，n 代表个体小鼠数量；对于体外图像，n 代表独立生物学重复的数量。数据以均值 ± 标准差表示；两组比较采用双尾 Student's t 检验，多组比较采用单因素方差分析及 Tukey 事后检验??。ns 表示无显著差异，?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001。

为了确定甲基化下调背后的特定酶，我们检测了主要 m6A 甲基转移酶和去甲基化酶的 mRNA 水平，包括写作蛋白 METTL3、METTL14 和 WTAP；擦除蛋白 ALKBH5 和 FTO；以及阅读蛋白 YTHDF2。其中，WTAP 在体内和体外显示出最显著的下调（图 3B–3D 和 S1），提示 WTAP 可能是导致烟雾暴露后观察到的全局 m6A 甲基化减少的主要介导者。

WTAP 敲低减弱上皮炎症、凋亡和 STAT3 激活
由于 WTAP 表达在烟雾暴露后自然下降，我们假设这可能代表一种内源性机制。我们使用慢病毒载体建立了一个稳定的 WTAP 敲低 MLE-12 细胞系（图 3E 和 3F）。在 SE 暴露下，与对照组相比，WTAP 沉默减少了炎症反应。TNF-α 和 IL-1β 表达水平显著降低（图 3H），而 Bcl-2 水平显著增加（图 3G 和 3K）。流式细胞术也显示了较低的凋亡率（图 3L）。这些发现表明，烟雾暴露期间敲低 WTAP 有助于限制过度凋亡和炎症。

此外，STAT3 是急性期反应中的关键转录介导者。我们确认了其损伤后的激活（图 1J 和 2H）。免疫印迹分析显示，SE 暴露后，WTAP 敲低细胞中总 STAT3 和磷酸化 STAT3（p-STAT3）水平均降低（图 3J）。这表明 WTAP 可能部分通过调节 STAT3 通路对炎症信号作出贡献。

WTAP 通过 m6A 介导的 mRNA 稳定性增强 pIgR 表达
然后，我们接下来试图确定 WTAP 的直接下游靶点。在我们之前的研究中，我们基于 p < 0.05 和|log2FC| > 1 的标准分析了烟雾损伤小鼠的肺组织转录组数据。差异表达分析鉴定出 496 个上调和 180 个下调基因（图 4A）。此外，构建了加权基因共表达网络分析（WGCNA），结果表明黑色模块与 SII 表型表现出最强的正相关（r = 0.96, p < 0.01）；相比之下，深绿松石色模块显示出最显著的负相关（r = ?0.99, p < 0.001）（图 4C）。

在图4D和4E中，韦恩分析在黑色模块与上调的差异表达基因（DEGs）之间鉴定出235个重叠基因，在深绿松石色模块与下调的DEGs之间鉴定出46个基因。其中，多聚免疫球蛋白受体（pIgR）在烟雾暴露后显示出最显著的上调（图4F）。

图4 WTAP直接下游候选靶标pIgR的鉴定

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（A–I）小鼠SII中差异表达基因的火山图；（B）WGCNA中的基因树状图和网络模块；（C）WGCNA中模块-性状关系的热图；（D）黑色模块与上调DEGs的韦恩图；（E）深绿松石色模块与下调DEGs的韦恩图；（F）包括pIgR、Ahsg、Wnt-7b和Cxcl17在内的顶级候选基因的mRNA水平RT-qPCR验证；（G）使用SRAMP数据库预测pIgR mRNA的m6A结合位点；（H和I）WTAP沉默的MLE-12细胞中pIgR在mRNA和蛋白水平的表达。对于A，原始数据集中每组n=3只小鼠。对于（F、H和I），n=3个独立生物学重复，其中n代表独立生物学重复的数量；（H）中的印迹为3次独立重复的代表。数据以均值±标准差表示，*p<0.05，**p<0.01。

鉴于pIgR是上调网络中的突出候选基因，我们通过SRAMP数据库预测了pIgR的潜在m6A甲基化位点。该数据库在756和772位鉴定出非常高置信度的m6A结合位点，在1356和3750位鉴定出高置信度的m6A结合位点（图4G）。在SE处理并敲低WTAP后，pIgR的mRNA和蛋白水平显著上调（图4H和4I）。此外，来自m6A2Target数据库的证据证实，pIgR是跨不同组织和物种高度保守的WTAP靶标（表S4）。

pIgR介导WTAP敲低在烟雾诱导的上皮损伤期间的保护作用

为探究WTAP敲低的保护效应是否依赖于pIgR，在MLE-12细胞中沉默了pIgR（图5A和5B）。pIgR敲低显著增强了炎症反应，表现为TNF-α和IL-1β表达增加，而Bcl-2显著降低（图5C和5D）。为验证与WTAP结合并被m6A甲基化直接修饰的特定pIgR mRNA位点，我们进行了MeRIP-qPCR分析。值得注意的是，756和772位点在pIgR转录本中位置相邻，因此我们在MeRIP-qPCR分析中使用的引物对涵盖了覆盖这两个位置的区域，并确认了pIgR mRNA中756/772区域m6A甲基化的富集（图5E和5F）。相比之下，在1,356和3,750位点的MeRIP-qPCR显示pIgR mRNA没有显著m6A富集，表明这些位点在该模型中不是pIgR mRNA的功能性m6A修饰位点（图S1E）。随后，WTAP敲低在SE暴露后显著降低了756/772区域内的m6A甲基化（图5G和5H）。由于m6A甲基化主要通过影响转录、翻译、核输出、剪接和稳定性来调控mRNA，我们使用放线菌素D评估了pIgR mRNA的半衰期。pIgR mRNA的半衰期（t1/2）从对照细胞的1.645小时延长到SE暴露后的2.557小时（图S1F）。如图5I所示，WTAP敲低显著延长了pIgR mRNA的半衰期，表明WTAP介导的m6A甲基化促进了pIgR mRNA的降解。

图5 WTAP敲低通过位点特异性m6A修饰稳定pIgR mRNA来减轻SE诱导的上皮炎症和凋亡

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（A–M）MLE-12细胞中pIgR敲低效率的验证；（C和D）pIgR敲低后TNF-α、IL-1β和Bcl-2的RT-qPCR分析；（E和F）确认756/772区域内pIgR m6A甲基化富集的MeRIP-qPCR分析；（G和H）确认WTAP沉默后756/772区域内pIgR m6A甲基化降低的MeRIP-qPCR分析；（I）SE暴露后WTAP沉默和对照MLE-12细胞中pIgR mRNA的稳定性，在放线菌素D处理后进行评估；WTAP敲低后pIgR敲低状态下TNF-α、IL-1β和Bcl-2的Western blot（J和K）和RT-qPCR（L和M）结果。n=3个独立生物学重复；（J）中的印迹为3次独立重复的代表。对于所有图片，n代表独立生物学重复的数量。数据以均值±标准差表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

最后，我们进行了功能拯救实验，在MLE-12细胞中同时敲低了pIgR和WTAP。单独WTAP敲低显著抑制了炎症细胞因子的表达，而pIgR敲低上调了TNF-α和IL-1β的表达（图5L），下调了Bcl-2（图5M），图5J和5K的Western blot结果证实了在蛋白水平上存在相同的调控。综合这些发现表明，WTAP下调主要通过稳定并上调pIgR来减轻烟雾诱导的上皮炎症和凋亡。

讨论

在本研究中，我们揭示了一种由m6A甲基转移酶WTAP驱动的潜在转录后调控机制。烟雾暴露降低了WTAP并减少了全局m6A水平。WTAP敲低进一步减轻了上皮炎症和凋亡，表明烟雾诱导的WTAP下调更可能代表一种内源性调控通路。我们进一步鉴定出pIgR是WTAP的下游靶标，WTAP敲低减少了pIgR mRNA上的m6A富集，延长了其半衰期，并增加了pIgR表达。

我们建立了烟雾发生装置并设置了小鼠SII模型。烟雾暴露破坏了肺泡-毛细血管屏障，增加了蛋白渗出，并大幅升高了TNF-α和IL-1β等促炎细胞因子的水平。这种强烈的炎症反应伴随着STAT3的激活。STAT3是固有免疫和细胞因子信号传导的关键介导者。我们观察到WTAP敲低有效减弱了STAT3激活并降低了整体炎症反应。尽管WTAP敲低抑制了STAT3/p-STAT3激活，而pIgR敲低逆转了WTAP敲低的抗炎和抗凋亡作用，但这些观察结果是在不同的实验组中获得的，因此代表的是关联关系而非pIgR与STAT3激活之间直接建立的因果关系。直接验证，例如通过pIgR胞质尾截短突变体或共免疫沉淀，将在后续工作中进行。

m6A甲基化是最常见的mRNA修饰之一，与免疫反应和炎症的调控密切相关。在严重烟雾暴露后，全局m6A甲基化水平和WTAP表达显著降低，与慢性吸烟者外周血中的观察结果一致。我们假设这种降低反映了上皮免疫反应的保护作用。我们的发现支持这一观点，即WTAP敲低有效减弱了烟雾诱导的上皮炎症和凋亡。值得注意的是，先前的研究表明，m6A写入酶METTL14的耗竭抑制病毒复制，而去除m6A擦除酶ALKBH5则促进病毒复制。WTAP耗竭也被证明通过降低IRF3和IFNAR1 mRNA的m6A甲基化水平来限制过度的干扰素信号传导，表明m6A写入酶的下调可能作为保护作用来约束过度的免疫激活。事实上，WTAP的具体调控机制在不同条件下是不同的。最近的研究报道WTAP在溃疡性结肠炎患者中显著上调，表现为促炎放大器。

结合DEGs和WGCNA，我们鉴定出pIgR是WTAP的关键靶标。m6A2Target数据库强烈支持pIgR跨不同组织是WTAP通过m6A甲基化作用的直接靶标。已知pIgR介导IgA的跨膜转运并维持肺黏膜免疫屏障。除了IgA的转运外，pIgR还通过影响细胞因子产生和上皮细胞行为来调节免疫反应。pIgR介导的黏膜防御不仅仅是转运IgA，还直接与慢性气道炎症重塑相关联。小鼠pIgR缺失会发展为类似COPD的表型，伴随细菌侵袭、中性粒细胞浸润和进行性小气道重塑。因此，我们发现WTAP下调后pIgR上调，这符合更广泛的背景，即保留pIgR表达对于气道炎症损伤具有保护作用。WTAP在炎症性肺损伤中表现为促炎放大器，WTAP缺失减轻了LPS诱导的脓毒症，与炎症期间WTAP依赖性m6A积累一致。在肺纤维化中，WTAP升高且表现为促纤维化，其沉默降低了全局m6A、TGF-β诱导的α-SMA、胶原III、增殖和迁移。这些发现表明，WTAP介导的m6A修饰具有高度背景特异性，由参与的下游转录本决定，而非由WTAP本身的促炎或抗炎作用决定。WTAP下调显著增加了pIgR表达，并进一步证实WTAP在pIgR mRNA的756/772区域内介导m6A修饰。我们还证明WTAP直接影响pIgR的mRNA稳定性，因为WTAP敲低后pIgR的mRNA半衰期显著延长。其作用机制可能涉及由各种通路触发的自发降解，如外泌体降解或m6A介导的mRNA降解。我们的发现显示，烟雾暴露诱导的WTAP下调导致pIgR mRNA的位点特异性低甲基化。mRNA稳定性增强导致损伤后pIgR蛋白表达显著增加。WTAP/m6A/pIgR轴可能代表抑制SII中肺炎症和凋亡的内源性调控通路。

总之，我们的发现突出了转录后RNA调控在烟雾吸入后上皮反应中的重要作用。我们提出，烟雾诱导的WTAP下调减少了pIgR mRNA上的m6A甲基化，从而稳定pIgR表达并限制过度的肺炎症和凋亡。这个WTAP/m6A/pIgR轴可能代表烟雾暴露的内源性调控通路，并为SII的早期干预提供潜在靶点。

研究局限性

本研究存在一些局限性。首先，m6A修饰是一个涉及多个写入酶、擦除酶和阅读蛋白的动态过程。尽管我们已经证实了WTAP在SII中的主要作用，但其他甲基转移酶也可能参与其中。此外，WTAP是否通过特定的阅读蛋白调节pIgR mRNA的稳定性需要进一步研究。其次，作为一种跨膜蛋白，pIgR的功能往往受到空间限制。本研究仅关注其与炎症的关联。未来研究需要阐明pIgR在肺泡上皮细胞膜上的定位及其与sIgA的相互作用。这将有助于我们全面了解它如何维持肺部免疫稳态。第三，我们没有进行体内AAV介导的敲低/拯救实验。通过体内干预建立这个轴是后续研究的重要优先事项。第四，我们的MeRIP-qPCR引物设计涵盖了相邻的756和772位点，无法区分它们的相对贡献；由于时间和资源限制，本次修订中未对每个位点进行定点突变以建立单位点特异性，计划作为后续工作的优先事项。

资源可用性

主要联系人

有关更多信息以及资源和试剂的请求应提交给主要联系人，并由郭光华（[e-mail]）满足。

材料可用性

本研究未生成新的独特试剂。所有商业可用试剂、抗体和细胞系均列在关键资源表中。

数据和代码可用性
- 本研究中重新分析的转录组数据集可从Jiang等人，2022年公开获取（https://doi.org/10.1080/21655979.2022.2037922）。原始原始数据（Western blot图像、流式细胞术文件和定量表）已存储在Mendeley Data中，自出版之日起公开可用。DOI列在关键资源表中。
- 本研究未生成任何原始代码。
- 重新分析本论文报告数据所需的任何其他信息均可在请求时从主要联系人获取。

致谢

本研究由国家自然科学基金委资助，批准号82160376s。

作者贡献

J.L.：数据整理、形式分析、概念化、软件、可视化、原始草稿撰写。S.H.：调查、验证、方法学、审稿与编辑。G.G.：概念化、项目管理、资金获取、资源、审稿与编辑。

利益声明

作者声明无利益冲突。

生成式AI和AI辅助技术在手稿准备过程中的使用声明

在准备本文手稿过程中，作者使用Gemini 3.1pro用于英语语言润色和语法纠正。作者已审阅和编辑输出内容，并对本出版物的内容承担全部责任。

STAR★方法

关键资源表

试剂或资源 | 来源 | 标识符
抗体：
- METTL3抗体 | Proteintech | Cat No. 15073-1-AP; RRID: AB_2142033
- METTL14抗体 | Proteintech | Cat No. 80790-1-RR; RRID: AB_2918912
- WTAP抗体 | Proteintech | Cat No. 60188-1-Ig; RRID: AB_10859484
- RBM15抗体 | Proteintech | Cat No. 10587-1-AP; RRID: AB_2175757
- STAT3抗体 | Abcam | Cat No. ab68153; RRID: AB_2889877
- p-STAT3抗体 | Abcam | Cat No. ab76315; RRID: AB_1658549
- GAPDH抗体 | Abcam | Cat No. ab181602; RRID: AB_2630358
- pIgR抗体 | R&D Systems | Cat No. AF2800; RRID: AB_2283871
- HRP偶联的山羊抗兔IgG | Proteintech | Cat No.

**关键商业试剂**

HRP偶联的山羊抗小鼠IgG
Proteintech，货号：SA00001-2；RRID：AB_2722564

HRP偶联的兔抗山羊IgG
Proteintech，货号：SA00001-1；RRID：AB_2722565

HRP偶联的鼠抗兔IgG
Proteintech，货号：SA00001-4；RRID：AB_2864335

**细菌和病毒菌株**

慢病毒：sh-WTAP（靶向小鼠Wtap的shRNA）
GenePharma，N/A

慢病毒：sh-pIgR（靶向小鼠Pigr的shRNA）
GenePharma，N/A

慢病毒：sh-NC（非靶向阴性对照shRNA）
GenePharma，N/A

**化学品、多肽和重组蛋白**

放线菌素D
MedChemExpress（MCE），HY-17559

DMEM/F-12培养基
Gibco, Thermo Fisher Scientific，11330032

胎牛血清（FBS）
Gibco, Thermo Fisher Scientific，A5256701

嘌呤霉素二盐酸盐
Beyotime，ST551

PMSF（苯甲磺酰氟）
Solarbio，P0100

RIPA裂解缓冲液
Beyotime，P0013

**关键商业检测**

EpiQuik m6A RNA甲基化定量试剂盒（比色法）
Epigentek，P-9005–96

EpiQuik CUT&RUN m6A RNA富集（MeRIP）试剂盒
Epigentek，P-9018–24

细胞计数试剂盒-8（CCK-8）
Beyotime，C0037

TransZol Up RNA提取试剂
TransGen Biotech，ET111-01

TransScript Uni All-in-One 第一链cDNA合成SuperMix
TransGen Biotech，AU341-02

TransTaq PCR SuperMix
TransGen Biotech，AS131-01

BCA蛋白检测试剂盒
Beyotime，P0010

Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒
Yeasen，40302ES60

**已存档数据**

烟雾吸入损伤小鼠模型的肺转录组数据（在本研究中重新分析）
Jiang等，https://doi.org/10.1080/21655979.2022.2037922

**实验模型：细胞系**

小鼠MLE-12肺上皮细胞系
Zishan Biotechnology，STCC20008P

**实验模型：生物体/品系**

小鼠C57BL/6J，雄性，6–8周龄
Vital River Laboratory Animal Technology，N/A

**寡核苷酸**

WTAP和pIgR的shRNA靶序列，见附表S1
本文，N/A

RT-qPCR引物序列，见附表S2
本文，N/A

靶向Pigr mRNA预测m6A位点的MeRIP-qPCR引物序列，见附表S3
本文，N/A

**软件和算法**

GraphPad Prism 9.0
GraphPad，N/A

ImageJ
Schneider等，https://imagej.net/ij/

FlowJo
BD，https://www.flowjo.com

RStudio版本4.3
Posit (RStudio)，N/A

DESeq2 R包
Love等，N/A

WGCNA R包
Langfelder等，N/A

SRAMP数据库
Zhou等，https://www.cuilab.cn/sramp

m6A2Target数据库
Yu等，https://rm2target.canceromics.org/

**其他**

用于动物模型的烟雾发生器（定制构建）
Li等，专利CN219614120U

**实验模型和受试者细节**

**动物**
雄性C57BL/6小鼠，6–8周龄，购自Vital River Laboratory Animal Technology有限公司。为减少激素周期相关的变异性，本研究仅使用雄性小鼠。这些小鼠饲养在南昌大学第一附属医院的无特定病原体（SPF）设施中，自由获取标准食物和水。饲养环境严格控制在12小时光照/12小时黑暗周期，温度维持在20°C–25°C，湿度为50%–70%。

**细胞系**
小鼠肺上皮细胞系MLE-12（货号STCC20008P，Zishan，中国）在DMEM/F-12（Gibco，美国）中培养，补充2%胎牛血清（FBS）（Gibco，美国），于37°C下在含5% CO?的湿润培养箱中培养。由于该细胞系尚未建立共识STR参考谱，物种鉴定由供应商通过物种特异性PCR完成。该细胞系常规采用PCR方法进行支原体检测，确认为阴性。

**伦理审批**
本研究经南昌大学第一附属医院实验动物伦理委员会批准（批准号：CDYFY-IACUC-202302QR057）。所有实验均符合相关指南和法规要求，并满足ARRIVE指南的要求。动物的饲养和护理按照中国实验动物学会《实验动物管理条例》和《动物福利法》指南执行。

**方法细节**

**烟雾发生器**
设计了一种烟雾发生器以建立烟雾吸入损伤（SII）模型，如前所述。烟雾发生器由两部分组成：燃烧室和动物室。锯末在燃烧室中被加热，产生的烟雾通过气泵泵入动物室。松木锯末在燃烧前于45°C过夜干燥。烟雾发生器配有控制单元，用于监测一氧化碳（CO）和氧气（O?）浓度。附加传感器实时监测室内温度。暴露温度、燃烧时间和气流通过数字界面控制。

**小鼠SII模型建立和烟雾提取物制备**
小鼠随机分为对照组和烟雾吸入（SI）组。SI组在动物室内暴露于烟雾，进行三轮连续循环，每轮3分钟烟雾暴露后接1分钟室内空气。对照组置于同一室内，暴露于室内空气。

烟雾提取物（SE）通过真空泵将新鲜产生的烟雾鼓泡通入20 mL无血清DMEM/F-12培养基中制备。所得溶液调节至pH 7.4，并通过0.22 μm无菌滤器过滤以去除颗粒物碎片和微生物污染。此制备定义为100% SE，可立即使用或在?80°C短期储存。SE用完全培养基稀释至最终浓度10%或20%用于体外模型。为限制批次间变异性，所有SE制备均遵循标准化方案。

**慢病毒转染**
靶向WTAP和pIgR的发夹RNA（shRNA）以及阴性对照（sh-NC）被包装成慢病毒载体，购自GenePharma（中国上海）（引物序列列于附表S1）。MLE-12细胞以每孔1.5 × 10?个细胞的密度接种于6孔板中，在5 μg/mL多聚鸟氨酸存在下感染慢病毒（1 × 10? PFU/mL）。12小时后更换为完全培养基。使用2 μg/mL嘌呤霉素（Beyotime，中国）筛选48小时以选择稳定敲低细胞。感染后通过RT-qPCR和Western blot验证敲低效率。

**H&E染色**
肺组织在4%多聚甲醛溶液中固定24小时，然后包埋于石蜡中。组织切片厚度为4 μm。切片经二甲苯脱蜡，通过梯度乙醇系列复水，然后用苏木精和伊红（H&E）染色。病理变化使用数字病理切片扫描仪（Soptop，中国）扫描。

**支气管肺泡灌洗液分析**
通过向气管内注入1 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）收集支气管肺泡灌洗液（BALF）。BALF在4°C下以2000 rpm离心15分钟。收集上清液进行BCA蛋白检测。

**划痕实验**
MLE-12细胞以每孔2×10?个细胞的密度接种于6孔培养板中，在37°C、5% CO?下培养至汇合。使用无菌200 μL移液器吸头在每个孔中制作线性划痕伤口。用PBS洗涤两次后，细胞在新鲜无血清培养基中培养。在0、24和48小时使用显微镜（Olympus，美国）拍摄划痕伤口图像。使用ImageJ软件（NIH，Bethesda, MD, USA）测量和分析伤口面积。伤口愈合率计算为[(0 h面积 ? 24/48 h面积) / 0 h面积] × 100%。

**细胞活力检测**
采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）（Beyotime，中国）评估细胞代谢活性。指定处理后，向每孔加入100 μL CCK-8溶液，在37°C下孵育2小时。然后使用酶标仪（Thermo Fisher Scientific，美国）在450 nm处测量吸光度。

**Western blot**
使用补充有PMSF（Solarbio，美国）的RIPA裂解缓冲液制备全细胞和组织裂解液。等量蛋白样品通过SDS-PAGE分离，然后电转至PVDF膜（0.22或0.45 μm）。膜用5%脱脂牛奶在室温下封闭1小时，然后在4°C下用一抗过夜孵育。随后膜在室温下与适当的HRP偶联二抗孵育1–2小时。使用ChemiDoc XRS+成像系统（Bio-Rad，美国）检测蛋白条带。

**RNA提取和RT-qPCR**
使用TransZol Up试剂（Transgen，中国）按照制造商说明提取总RNA。然后，1 μg RNA使用TransScript? Uni SuperMix（Transgen，中国）进行逆转录，并使用TransTaq? PCR SuperMix（Transgen，中国）通过Applied Biosystems StepOne Plus实时PCR系统（Thermo Fisher，美国）进行一步法PCR扩增的RT-qPCR。相对基因表达水平使用2?ΔΔCt法定量，GAPDH作为内参对照。引物序列（5'–3'）和热循环条件列于附表S2。

**流式细胞术分析凋亡**
使用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（Yeasen，中国）按照制造商说明评估细胞凋亡。简要步骤：消化细胞后以300 g离心5分钟，用冷PBS洗涤两次。细胞沉淀用1×结合缓冲液重悬，密度为1–5 × 10?个细胞/mL，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色溶液，在室温避光条件下染色10–15分钟，并设置未染色、Annexin V-FITC单独和PI单独的对照用于补偿。加入400 μL 1×结合缓冲液后，样品在冰上保存并在1小时内使用流式细胞仪（BD Biosciences，美国）分析。使用FlowJo 10（BD，美国）从FITC/PI双参数点图中定量凋亡细胞。

**m6A RNA甲基化定量**
使用EpiQuik? m6A RNA甲基化定量试剂盒（Epigentek，美国，货号P-9005）按照制造商说明检测全局m6A RNA甲基化水平。简要步骤：生成标准曲线以及阳性对照和阴性对照。然后，将输入RNA加入检测孔中与m6A特异性抗体混合。经过抗体溶液洗涤、捕获和增强后，使用酶标仪（Thermo Fisher，美国）在450 nm处比色定量吸光度。

**转录组数据分析和WGCNA**
烟雾吸入损伤（SII）后小鼠肺组织的转录组数据来源于我们先前发表的文章。在RStudio（版本4.3）中使用DESeq2 R包进行差异表达分析。差异表达基因（DEGs）基于|log?FC| > 1且p < 0.05的阈值定义。然后，使用WGCNA R包基于标准化表达矩阵进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）。基于中位绝对偏差（MAD）对基因进行过滤以确保网络可靠性。为构建无标度拓扑，选择软阈值9，该值提供无标度拓扑拟合指数（R2）> 0.8。通过动态树切割识别模块，并与SII表型相关以评估模块-表型关系。

使用韦恩分析鉴定模块和DEGs的重叠基因以确定潜在基因（多条转录本映射到同一基因时保留一个独特基因符号）。候选基因进一步根据与黏膜免疫和上皮功能的相关性进行筛选。然后，使用SRAMP数据库预测pIgR mRNA序列上潜在的m6A修饰位点。支持pIgR作为m6A甲基化书写酶WTAP靶基因的证据来自m6A2Target数据库。

**MeRIP-qPCR**
使用EpiQuik? CUT&RUN m6A RNA富集（MeRIP）试剂盒（Epigentek，美国）按照制造商方案富集m6A修饰RNA。简要步骤：200 ng总RNA与10 μg抗m6A抗体或IgG对照进行免疫捕获和切割。使用RNA结合磁珠进行RNA纯化。然后，在洗脱缓冲液中释放富集RNA。富集RNA经纯化后进行RT-qPCR。富集程度相对于IgG计算并归一化至输入RNA。靶向pIgR mRNA预测m6A位点的引物基于SRAMP数据库设计。引物序列列于附表S3。

**mRNA稳定性实验**
在WTAP敲低和8小时SE暴露后，加入放线菌素D（5 μg/mL）（MCE，美国）抑制转录。在0、1、2、3和8小时收获细胞进行RT-qPCR。mRNA衰减速率通过归一化至0小时时间点计算。

**定量和统计分析**
使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）进行统计分析。实验数据以均值 ± 标准差（SD）表示。两组比较采用双尾Student's t检验，多组比较采用单因素方差分析后进行Tukey事后检验。p < 0.05被视为具有统计学意义。

对于体内实验，n代表每组个体小鼠数量（SII模型每组n = 5）。对于体外实验，n代表独立生物学重复次数（通常每组n = 3）。RT-qPCR数据使用2?ΔΔCt法归一化至GAPDH。稳定性实验中mRNA半衰期值通过相对于0小时时间点的一级指数衰减拟合计算。

Western blot的灰度定量使用ImageJ软件（NIH, Bethesda, MD, USA）进行并归一化至GAPDH。流式细胞术凋亡数据使用FlowJo 10（BD, USA）分析。包括差异表达（DESeq2 R包）和加权基因共表达网络分析（WGCNA R包）在内的生物信息学分析在RStudio版本4.3中进行，详见方法细节部分。

**补充信息（2项）**
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文档S1. 附图S1和附表S1–S4
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数据S1. 原始印迹图像，与图1–5及图S1相关