基于Fe3O4@Au纳米酶与CHA-PET-RAFT级联反应的协同三重放大电化学发光生物传感器用于灵敏检测烟草花叶病毒RNA

《Analytica Chimica Acta》：A synergistic triple-amplification electrochemiluminescence biosensor using Fe 3O 4@Au nanozymes and CHA-PET-RAFT cascade for sensitive detection of TMV RNA

　　

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  双功能Fe₃O₄@Au纳米酶作为稳健的纳米载体和ECL共反应加速剂。
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  三重信号放大策略整合了纳米酶、CHA和PET-RAFT级联反应。
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  光驱动的PET-RAFT引导发光胺接枝聚合物链的原位生长。
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  该生物传感器在实际植物RNA提取物中检测TMV RNA的检出限达0.17 pM。

引言

烟草花叶病毒（TMV）是一种具有高度传染性的正义单链RNA病毒，在农业中造成严重的经济损失[1], [2]。因此，开发高灵敏度、高可靠性的分析方法用于植物中TMV RNA的早期检测，对疾病管理和防控至关重要[3], [4]。目前TMV RNA的常规检测技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[5]、聚合酶链式反应（PCR）[6]、高通量测序（HTS）[7]和逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）[8]。尽管这些方法能够实现病毒的精确RNA检测，但常受限于繁琐的操作流程、严格的环境要求以及对专业仪器的严重依赖。为解决这些技术瓶颈，迫切需要开发简便、超灵敏且经济高效的病毒RNA传感策略。

电化学发光（ECL）已成为一种高灵敏度的分析技术，具有光学配置简化、成本效益高和操作简便等独特优势[9]。作为生物医学传感和临床诊断的强有力分析工具，ECL结合了发光的高灵敏度与电化学方法的精确时空可控性，从而能够实现原位监测和动态分析。常用的ECL发光体包括三(2,2'-联吡啶)钌(II)（Ru(bpy)₃²⁺）、量子点（QDs）和鲁米诺衍生物[10], [11]，其中鲁米诺表现出卓越的发光效率。例如，Zhang等人利用二维Ti₃C₂ MXene纳米片作为平台增强鲁米诺的ECL发射[12]。然而，由于鲁米诺通常作为溶液中自由扩散的物质使用，其在电极界面处易快速耗竭和信号衰减。为克服这一挑战，将鲁米诺固定在修饰电极表面可减小扩散距离，从而加速电子转移并增强局部发光强度。

为充分发挥固定化鲁米诺体系的潜力，引入高效的共反应加速剂至关重要。在这方面，各种功能性纳米材料越来越被认为是构建先进生物传感器的关键组分。Fe₃O₄纳米颗粒（Fe₃O₄NPs）因其固有的过氧化物酶样活性、磁可控性和高生物相容性而被广泛用作电极基质[13]。尽管Fe₃O₄NPs能高效催化共反应物并放大信号，但其固有的聚集倾向常常削弱其活性表面积和整体催化效率[14]。为缓解这一问题，将Fe₃O₄NPs包封在贵金属（如金纳米颗粒AuNPs）中已被证明能增强结构稳定性和亲水性。此外，AuNPs具有优异的导电性、强表面等离子体共振吸收和高消光系数[15]。由此产生的核壳结构Fe₃O₄@AuNPs协同发挥两种组分的优势，产生高活性纳米催化剂，显著增强鲁米诺体系的ECL效率[16]。

虽然基于纳米复合物的加速剂提供了优异的信号增强，但实现痕量病毒RNA的超灵敏检测还需要额外的靶标催化扩增策略。为此，已建立的核酸扩增技术，如杂交链式反应（HCR）[17]、滚环扩增（RCA）[18]、环介导等温扩增（LAMP）和催化发夹组装（CHA）[19]，常被用于实现ECL信号的多级放大。CHA以立足点介导的DNA链置换机制为特征，具有等温操作和消除蛋白酶依赖等显著优势。此外，CHA的高度特异性有助于从复杂生物基质中实现对TMV RNA的强效辨别。因此，ECL与CHA扩增的整合是构建高性能传感平台的强有力方法。

为实现鲁米诺的高度有序、位点特异性固定化，并将其与上述扩增策略无缝整合，可控聚合技术的进展被用于精确调控传感器的制备[20]。具体而言，可逆失活自由基聚合（RDRP）被广泛用于构建信号放大聚合物刷，这些聚合物刷能稳定锚定发光体，同时最小化背景噪声并最大化ECL输出。代表性技术包括原子转移自由基聚合（ATRP）[21], [22]和可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合[23]。与通常需要有毒过渡金属催化剂的ATRP不同，RAFT聚合通过链转移剂（CTAs）的快速退化链转移，实现结构明确聚合物的可控合成，提供优异的官能团耐受性并减轻不可逆终止反应[24], [25]。在此基础上，光诱导电子/能量转移-可逆加成-断裂链转移（PET-RAFT）聚合的出现，将传统聚合与可见光调控的光氧化还原催化相结合，代表在环境条件下实现精确空间控制的重大里程碑[26]。

在本研究中，我们提出一种逐步组装的ECL生物传感平台，利用Fe₃O₄@AuNPs、靶标触发的CHA和高效PET-RAFT聚合的协同特性。水热法合成的Fe₃O₄@AuNPs因其固有的过氧化物酶样活性，可作为优异的共反应加速剂，催化H₂O₂分解产生超氧自由基（O₂•^?）等活性氧物种（ROS），从而显著放大ECL发射。CHA机制实现了靶标循环用于初级信号放大，而PET-RAFT则促进了精确控制的聚合物链生长，将鲁米诺高效接枝到电极表面。这项工作具有几个显著优势：（1）开发了高度集成的生物传感器，通过聚合物刷介导的固定化有效减轻了溶解鲁米诺的扩散诱导信号损失；（2）利用CHA和PET-RAFT确保了环境条件下的高操作效率和可控性，与绿色分析化学原理无缝契合；（3）整合Fe₃O₄@AuNPs作为高效纳米催化剂，加速了H₂O₂活性自由基的生成，有效提高了传感器的分析灵敏度和界面稳定性。

章节片段

材料、试剂与仪器

本研究中使用的材料、试剂和仪器详见补充材料。本工作中使用的所有寡核苷酸序列列于表S1中。

AuNPs的合成

金纳米颗粒（AuNPs）采用经典柠檬酸盐还原法合成，参照先前报道的方案[27]。合成前，所有玻璃器皿均用新配制的王水（HCl:HNO₃ = 3:1，v/v）仔细清洗，用超纯水充分冲洗，并在氮气流下干燥。

基于三重信号放大策略的ECL生物传感器原理

在本研究中，我们提出了一种新颖的ECL生物传感平台的构建，该平台采用级联三重信号放大策略用于TMV RNA检测。如方案1A所示，逐步制备过程首先将Fe₃O₄@AuNPs沉积在玻碳电极（GCE）上，以增加电活性表面积并加速电子转移。这些纳米复合材料同时作为电极基质和共反应加速剂。随后，HP2的末端氨基

结论

总之，本研究提出了一种基于三重放大策略的ECL生物传感器，用于TMV RNA的高灵敏检测。该传感范式整合了靶标触发的催化发夹组装（CHA）和表面限域的PET-RAFT聚合，利用双功能Fe₃O₄@Au纳米酶作为支撑基质。这些磁性纳米结构同时作为稳健的纳米载体和纳米酶，高效催化H₂O₂，大幅增强鲁米诺-H₂O₂体系的ECL发射。

CRediT作者贡献声明

Lele Ma: 写作 – 初稿，验证，调查，经费获取，形式分析，数据管理。 Liying Zhao: 写作 – 初稿，可视化，软件，调查，形式分析。 Zhixiang Liu: 写作 – 初稿，软件，概念化。 Kunlin Liu: 形式分析，概念化。 Huaixia Yang: 写作 – 审阅与编辑，监督，概念化。 Mingsan Miao: 写作 – 审阅与编辑，监督，资源，概念化。 Yanju Liu:

利益声明

作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，可能影响本论文所报告的工作。

数据可用性

数据将按要求提供。

竞争性利益声明

? 作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，可能影响本论文所报告的工作。

致谢

本工作得到河南省自然科学基金（编号252300420604）、河南省大学生创新创业训练计划项目（编号202510471031）和河南省博士后科研项目（博士后编号279363）的资助。

Lele Ma|Liying Zhao|Zhixiang Liu|Kunlin Liu|Huaixia Yang|Mingsan Miao|Yanju Liu