用于同时测定人血清中全氟和多氟烷基物质与尼古丁代谢物的顺序提取方案，采用高分辨率质谱法

《Analytica Chimica Acta》：A Sequential Extraction Protocol for the Simultaneous Determination of Per- and Polyfluoroalkyl Substances and Nicotine Metabolites in Human Serum Using High-Resolution Mass Spectrometry

　　摘要要点：• 一种单次进样方法，用于同时测定血清中的尼古丁代谢物和33种PFAS。• 同位素稀释高分辨质谱确保高选择性、准确度及基质效应控制。• 两次pH调节和极性梯度液液萃取可提取理化性质迥异的待测物。• 优化的液相色谱与样品前处理实现了简便、高通量、低成本生物监测。• 经ICH M10验证，并应用于中国国家人体生物监测及能力验证样品分析，证明方法适用性。引言：人体生物监测正日益转向“暴露组”框架，这一框架允许同时测量多种暴露生物标志物。然而，这一目标往往受到目标分析物理化性质异质性的限制。具有不同特性的化合物非常常见，例如疏水性与亲水性物质，或阴离子与阳离子物质。常规生物监测通常采用不同的样品前处理方案，需要不同的色谱条件并分别进行分析。常规代谢组学前处理方法缺乏特异性；虽然它们能够实现多种化合物类型的同步定量和半定量分析，但对某些化合物往往无法获得令人满意的准确度。因此，当前生物监测中的多组分分析仍然依赖于同一生物样品的多个分取等分试样。分开的分析批次增加了所需样品体积、提高了分析成本，并加剧了批间变异性，带来显著限制——尤其是在儿童和老年人的生物监测中。因此，一种能够从单一小体积样品中提取化学性质差异巨大的待测物的方法，将标志着暴露科学的重要进步。全氟和多氟烷基物质（PFAS）与尼古丁代谢物正是这一挑战的典型代表。它们也适合作为开发统一提取策略的模型化合物。这两类待测物在全球主要人群生物监测项目中均被常规检测。[1]、[2]、[3]、[4] PFAS在环境中难以降解并对健康构成风险。尼古丁代谢物可用于评估人群的烟草暴露。现有检测方法通常需要对每类物质分别进行样品前处理和独立分析测定。[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14] 目前，一些研究者已采用组学方法同时测定血清中不同类型的化合物；然而，PFAS和尼古丁代谢物的回收率并不理想，范围为49%至108%。[15]、[16] 现有方法中常用的样品净化策略主要包括固液萃取（SLE）、液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）。组学方法也报道了使用甲醇或乙腈直接蛋白沉淀（PPT）的方法。然而，我们认为仅靠PPT不足以有效去除干扰物；SPE选择性最高，但提取酸性和碱性化合物的能力有限；SLE不允许二次pH调节；且SPE和SLE的成本均高于LLE。Bangma等人报道了在液相色谱-三重四极杆串联质谱（LC-QqQ-MS/MS）中PFBA存在同位素干扰的风险。[17] 该研究发现，一种内源性饱和羰基脂肪酸与PFBA共洗脱，导致76%的胎盘样本中PFBA浓度被高估。有报告还指出，PFOS和PFHxS表现出类似的干扰效应，其归因于内源性胆汁酸和类固醇硫酸盐。这些发现凸显了使用LC-QqQ-MS/MS定量分析复杂生物基质中PFAS的重大局限性。同时测定这两类化合物具有挑战性，因为它们的理化性质差异显著。为确保方法的广泛适用性，共选择了33种PFAS，包括在中国国家人体生物监测（CNHBM）人群中检出率较高的物质：全氟辛酸（PFOA）、全氟辛磺酸（PFOS）、全氟癸酸（PFDA）、全氟壬酸（PFNA）、全氟十一酸（PFUdA）、全氟己磺酸（PFHxS）、全氟庚磺酸（PFHpS）和6:2氯化多氟醚磺酸盐（6:2Cl-PFESA）；[2] 一些新型替代物包括：六氟环氧丙烷二聚酸（HFPO-DA）、4,8-二氧代-3H-全氟壬酸（ADONA）和8:2氯化多氟醚磺酸盐（8:2 Cl-PFESA）；全氟烷基磺酰胺类前体包括：N-甲基全氟辛磺酰胺乙酸（N-MeFOSAA）、N-乙基全氟辛磺酰胺乙酸（N-EtFOSAA）和全氟辛磺酰胺（FOSA）；氟调聚物磺酸盐包括：4:2、6:2和8:2氟调聚物磺酸盐（4:2 FTS、6:2 FTS和8:2 FTS）；此外，C4–C14同系物的全氟烷基羧酸和全氟烷基磺酸组包括全氟丁酸（PFBA）、全氟戊酸（PFPeA）、全氟己酸（PFHxA）、全氟庚酸（PFHpA）、全氟辛酸（PFOA）、全氟壬酸（PFNA）、全氟癸酸（PFDA）、全氟十二酸（PFDoA）、全氟十三酸（PFTrDA）和全氟十四酸（PFTeDA）、全氟丁磺酸盐（PFBS）、全氟戊磺酸盐（PFPeS）、全氟己磺酸盐（PFHxS）、全氟辛磺酸盐（PFOS）、全氟壬磺酸盐（PFNS）和全氟癸磺酸盐（PFDS）。尼古丁代谢物包括可替宁（COT）和羟基可替宁（HC）。PFAS是酸性化合物（大多数PFAS的pKa < 1）；在生理pH下，大多数PFAS完全电离为阴离子。由于氟原子的强亲电性促进H+解离，其酸性和极性随官能团和链长而变化；极性随碳链长度增加而降低。相比之下，COT和HC是弱碱性化合物（pKa在8至9之间），在生理pH下以阳离子形式存在。HC和COT含有羟基、内酰胺和氨基等极性官能团，赋予其强极性和高水溶性。鉴于PFAS和尼古丁代谢物在极性和pH方面的广泛差异，我们选择了通用性更强的LLE方法处理血清。为尽可能完全地将PFAS转移至有机相，思路如下：首先加入强酸使蛋白变性，破坏蛋白质与PFAS之间的结合，将PFAS释放为游离态。由于大多数PFAS为强酸性，仅通过降低pH难以将其转化为分子形态——从而提高LLE效率——必须结合其他措施，如盐析、离子对萃取和使用极性相近的有机溶剂，以增强PFAS的萃取效率。PFAS被萃取后（水相pH < 1），由于COT和HC的pKa为8–9，它们以离子形式保留在水相中。接下来，将剩余水相强碱化（pH > 12），以中和上一步加入的酸并将血清pH调至碱性范围。碱化抑制了剩余水相中尼古丁代谢物的解离，并将其转化为中性分子形态。随后，第二次LLE将尼古丁代谢物转移至有机相2。然后将所有有机相合并，实现对酸性和碱性待测物的有效萃取。基于这一思路，我们开发了一种基于96孔板的预处理方法，在两次pH调节后采用极性梯度溶剂LLE。这一优化的预处理方法能够从100 μL血清样品中萃取33种PFAS和两种尼古丁代谢物。使用极性切换的高分辨质谱（HRMS）检测待测物：PFAS在负离子模式下扫描，COT和HC在正离子模式下扫描。质量提取窗口设置为<5 ppm以消除潜在的同位素干扰。在验证了线性范围、灵敏度、回收率、精密度和基质效应后，我们将该方法应用于166份血清样品的分析。结果表明，该方法可同时定量单个血清样品中的33种PFAS、COT和HC化合物。总之，该方法提供了一种准确、高效、低成本且节省样品体积的定量解决方案，特别适用于大规模生物监测应用。章节片段：化学品、试剂和标准品HC、COT和D3-COT标准溶液（1.0 g/L）以及D3-HC标准溶液（100 mg/L）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。PFAS标准溶液（产品编号：EPA-1633STK、EPA-533）和同位素标记内标溶液（产品编号：MPFAC-HIF-ES）为混合溶液，购自Wellington Laboratories（加拿大安大略省圭尔夫）；超纯水使用Milli-Q IQ 7005纯水系统（德国达姆施塔特默克公司）制备。LC–MS级（原文截断）液相色谱条件优化通过调节流动相梯度和NH4AC浓度优化了PFAS和尼古丁代谢物的色谱条件。在流动相管路中上游安装隔离柱（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）作为捕集柱，以抑制系统产生的背景干扰。使用ACQUITY UPLC BEH C18分析柱（2.1 × 100 mm，1.7 μm）进行色谱分离。评估了三种NH4AC浓度——2、5和10 mmol/L。NH4AC（原文截断）结论总之，本研究开发了一种将极性梯度溶剂LLE与LC-Q-Orbitrap HRMS相结合的方法。该方法仅需100 μL人血清即可同时测定尼古丁代谢物和33种PFAS。通过逐步调节血清pH并结合极性梯度溶剂LLE，可从单一样品中高效提取酸性和碱性化合物。这一简化流程显著减少了样品前处理时间和成本。方法的检出限（0.006–0.2 μg/L）为（原文截断）CRediT作者贡献声明Xiaoming Shi：写作——审阅与编辑、项目管理、经费获取。Haijing Zhang：写作——审阅与编辑、验证、方法学、经费获取。Yifu Lu：写作——审阅与编辑。Changming Ding：写作——初稿、可视化、验证、方法学、形式分析、概念化利益冲突声明? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：本研究由国家自然科学基金（82388102、82025030、82530104、82222063）、国家重点研发计划（2023YFC3905204）以及中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所青年学者科研基金（25qnjj03）资助。如有其他作者，其声明无（原文截断）致谢本研究由国家自然科学基金（82388102、82230111、82530104）、国家重点研发计划（2023YFC3905204）、非传染性慢性病——国家科技重大专项（2024ZD0531600）以及中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所青年学者科研基金（25qnjj03）资助。Changming Ding|Yifu Lu|Haijing Zhang|Xiaoming Shi