基于熔解曲线分析的通用引物介导多重实时PCR检测方法用于多种病毒靶标的检测

《Analytical Biochemistry》：Melting curve analysis-based multiplex real-time PCR assay mediated by universal primers for detection of multiple virus targets

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  开发了一种结合EvaGreen熔解曲线分析的通用引物多重实时荧光定量PCR（UP-M-qPCR）方法。
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  该方法以五种猪腹泻病毒为模型，可同时特异性检测这些病毒。
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  即使在高水平共感染背景下，该方法的检测限仍可达5拷贝/μL。
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  该方法提供了一个易于适配多种病毒靶标检测的技术平台。

引言

实时荧光定量PCR（qPCR）是一种强大的核酸检测和定量方法[1]，它通过封闭管系统中的荧光强度变化，实时动力学地检测扩增产物的积累[2]，无需进行电泳等扩增后操作即可鉴定产物，从而缩短了检测周期，最小化了交叉污染的可能性，并增强了严格评估方法性能的能力[3]、[4]。它被誉为分子诊断领域的卓越使能技术，涵盖生命科学、农业和医学领域[5]。然而，在许多需要检测多种核酸靶标的情况下，例如几种具有相似临床表现的病原体同时流行时，单一qPCR无法满足实际需求。因此，多重qPCR（M-qPCR）应运而生，它能够在单管中实现对多个靶标的准确检测，是一种便捷且节省时间的解决方案[6]、[7]。

目前，M-qPCR检测方法主要分为两大类：基于荧光探针的检测和基于双链DNA结合荧光染料的检测[8]。TaqMan探针等荧光基团与寡核苷酸相连，仅能检测特异性扩增产物[9]。TaqMan探针的使用受限于其合成成本高且耗时。此外，探针结合区域的序列变异可能导致较高的假阴性率[8]。因此，基于荧光染料的检测受到越来越多的关注。SYBR Green I（SGI）和EvaGreen（EG）是最常用的荧光染料，通过荧光染料结合DNA的小沟区域并配合熔解曲线分析，可以区分特异性与非特异性扩增产物[8]。然而，为减少SGI对PCR的干扰所需使用的低浓度带来了几个缺点，包括DNA熔解曲线分析过程中染料再分布的可能性、动态范围受限以及与其他检测方法相比可重复性降低[10]、[11]。因此，SGI通常不推荐用于需要重复熔解分析、多重PCR或高分辨率基因分型的应用[12]。相比之下，EG是一种专门设计用于特异性结合DNA的新型荧光染料，与SG相比，EG对qPCR扩增的抑制作用极小，降低了非特异性扩增的风险[10]、[12]、[13]、[14]，在多靶标检测中表现更优[15]。PCR过程完成后，通过计算荧光值对温度的负导数进行熔解曲线分析，获得扩增产物的熔解曲线，从而确定每种产物的特征熔解温度（T_m）来识别和区分各靶标[16]。

然而，M-qPCR与常规多重PCR一样，通常存在引物间干扰的固有问题[17]，导致引物二聚体或茎环结构的形成、引物诱导的自我抑制以及因引物不均一性导致的扩增不一致[18]，从而削弱了其性能。为解决这一弱点，我们研究组及其他研究人员引入了通用引物（UP），以最大限度地减少常规多重PCR中的扩增不平衡，并实现更高的特异性和灵敏度[19]、[20]、[21]。UP是一种长度为10-30个核苷酸的人工寡核苷酸，与目标核酸无同源性，与嵌合引物（CP）协同发挥作用，CP由UP连接至靶标特异性引物5'端衍生而来[17]、[22]。UP在M-PCR中具有巨大的潜在价值，因为它可以容易地与各种靶标特异性引物组合，且仅需少量CP即可引导UP主导的均匀扩增，从而实现高特异性、灵敏度和通量[17]、[23]。

高灵敏度和准确性的病原体检测对于其所致疾病的诊断和治疗至关重要。猪流行性腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪圆环病毒2型（PCV2）以及猪轮状病毒A（RVA）和C（RVC）是导致猪病毒性腹泻的常见病原体，在临床中常表现为共感染。在本研究中，我们将UP与M-qPCR结合熔解曲线分析，以五种病毒为案例研究，在单管反应中开发了一种基于UP的M-qPCR（UP-M-qPCR）检测方法。我们评估并证明了UP在减少特异性引物用量、最大限度减少扩增不平衡可能性以及增强特异性和灵敏度方面的有效性。此外，通过使用单一qPCR检测方法和现场样本对该方法的诊断性能进行了评估。

章节摘要

靶标与样本

五种与猪腹泻病相关的靶标病毒，包括：传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒A（RVA）、猪轮状病毒C（RVC）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）和猪圆环病毒2型（PCV2）的诊断区域质粒及其病毒DNA/cDNA，以及五种分析特异性对照，即猪博卡病毒（PBoV）、猪星状病毒（PAstV）、猪圆环病毒1型（PCV1）、猪细小病毒1型和猪瘟病毒疫苗株。

CP的有效性

在模板浓度为5×10⁵拷贝/μL时，使用五种病毒对应的CP进行单一qPCR扩增。如图1所示，观察到TGEV（T_m为79.7 °C）、RVA（81.3 °C）、RVC（84.3 °C）、PEDV（86.6 °C）和PCV2（88.2 °C）具有明显且特异性的熔解峰，能够可靠地区分五种靶标病毒，而阴性对照未产生任何非特异性熔解峰。结果表明，设计的CP可用于

讨论

近年来，分子检测技术，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）、环介导等温扩增（LAMP）、基因芯片、PCR和实时荧光定量PCR（qPCR），被广泛用于病毒病原体检测。在这些方法中，qPCR仍然是最受欢迎的检测技术之一，因为它具有高灵敏度、广泛的适用性，且扩增后无需打开反应管，从而降低了污染风险[14]。由于

结论

本研究成功建立了一种基于通用引物和熔解曲线分析的新型多重qPCR平台，具有成本低、灵敏度和特异性高、操作简单且通量高的特点。UP和CP的联合使用显著提高了检测方法的特异性和灵敏度。使用UP对不同靶标进行等效率扩增，最大限度（甚至完全避免了）减少了扩增不平衡，同时显著增强了引物的

CRediT作者贡献声明

南沛：调查研究、数据管理。孟子轩：撰写——初稿、形式分析、数据管理。姜永厚：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法论、资金获取、概念化。任宣义：撰写——初稿。温丹：调查研究。

数据可用性

本研究期间生成和/或分析的数据集已在本手稿中提供，测序数据已存入GenBank数据库，登录号为PX992787-PX992796。

伦理声明

本研究仅涉及在获得农场主知情同意的情况下，从商业养殖场猪只中非侵入性地采集粪便样本。由于采样未进行任何侵入性操作，本研究不构成临床试验，因此不适用临床试验伦理审查。尽管本研究不需要按照ARRIVE指南或美国国立卫生研究院（NIH）指南进行正式伦理审查，但我们遵循了

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

资金支持

本研究由浙江省自然科学基金（LGC21C180002）资助。

利益冲突声明

作者声明不存在任何已知的可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

Zixuan Meng|Pei Nan|Dan Wen|Xuanyi Ren|Yonghou Jiang