NR2F6作为关键的转录检查点，导致人类CD3+ T细胞功能障碍并限制CAR-T细胞效力

《iScience》：NR2F6 functions as a key transcriptional checkpoint enforcing dysfunction of human CD3+ T cells and limiting CAR-T cell potency

　　

## 要点

- NR2F6的抑制功能在人类T细胞中是保守的
- NR2F6对T细胞的广泛抑制作用影响NFAT、AP-1和NF-κB信号通路
- NR2F6以背景依赖的方式调节TCF-1相关程序
- NR2F6升高限制CAR-T细胞在系列肿瘤挑战中的杀伤能力

## 摘要

尽管核受体亚族2F组第6成员（NR2F6）在小鼠模型中调节淋巴细胞激活，但其功能在人类T细胞中仍未被完全定义。本研究鉴定出NR2F6是一种T细胞受体（TCR）诱导的转录检查点，限制人类CD3? T细胞（包括嵌合抗原受体（CAR）T细胞）的效应能力。在抗EGFR CAR-T细胞-A549共培养模型中，强制NR2F6表达（模拟其在肿瘤浸润淋巴细胞中的上调）显著损害重复肿瘤挑战下的杀伤能力。在多克隆T细胞中，NR2F6过表达和CRISPR-Cas9介导的缺失产生了方向相反的效果，支持其作为激活、分化相关程序和细胞因子产生的负调控因子的角色。机制上，转录组、表观基因组和核蛋白分析表明抑制了NFAT、AP-1和NF-κB相关通路，并揭示了TCF-1相关读数中的背景依赖性变化。总之，这些发现将NR2F6定位为一种整合信号的转录检查点，有助于失调的T细胞状态的形成，并可能在人类中促进肿瘤免疫逃逸。

## 图形摘要

（无文本内容）

## 引言

鉴定出限制抗肿瘤免疫的新靶点是癌症免疫疗法中的一个关键挑战。尽管免疫检查点阻断和过继细胞疗法取得了突破性进展，但仍有相当一部分患者无法产生持久反应，这凸显了克服免疫逃逸机制并更有效地提升癌症免疫周期的需求。持续抗肿瘤反应的主要障碍之一是T细胞功能障碍，这是一种渐进性状态，其特征是效应功能受损、分化轨迹改变以及建立限制肿瘤微环境中细胞毒性能力的转录程序。

最近来自小鼠模型的研究已证实，孤儿核受体NR2F6（核受体亚族2F组第6成员）是T细胞反应的强效负调控因子和关键的肿瘤免疫检查点。小鼠中Nr2f6基因敲除显著增强了抗肿瘤免疫，并与免疫检查点阻断协同，凸显了其在癌症免疫中的因果作用。值得注意的是，NR2F6在肿瘤组织中上调与多种人类恶性肿瘤的不良预后相关，且在非小细胞肺癌中已证明肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中NR2F6高表达。后一发现表明肿瘤内在机制驱动NR2F6表达作为一种免疫逃逸策略。

机制上，NR2F6被提出作为一种转录抑制因子，通过削弱T细胞受体（TCR）诱导的细胞因子产生和效应基因表达来发挥作用。在小鼠T细胞中，NR2F6干扰TCR信号下游关键转录调控因子的可及性和活性，从而设定激活阈值。然而，T细胞反应并不仅由急性激活事件定义，而是由紧密协调的命运决定所支配，决定细胞采取效应、记忆、祖细胞耗竭或终末功能障碍状态。这些谱系轨迹由相互连接的转录因子网络编排，并深受癌症中持续性抗原刺激的影响。

NR2F6是否有助于失调的T细胞状态的建立或稳定，以及它如何与核心命运决定因子相互作用，仍未被完全理解，尤其是在人类系统中。解决这些问题对于评估NR2F6作为治疗靶点的转化潜力至关重要，特别是在工程化T细胞疗法中，内在检查点可能会限制疗效。

为弥补这一空白，我们采用了一种结合抗生素选择的慢病毒遗传扰动策略，以实现对原代人类T细胞中NR2F6的稳健调控。利用这一平台，我们系统地通过正交读数 interrogated了NR2F6功能，包括嵌合抗原受体（CAR）-T细胞实验、流式细胞术、RNA测序和转录因子活性分析。我们的发现揭示，NR2F6介导的T细胞功能抑制在小鼠和人类之间是进化保守的，且NR2F6作为一种TCR诱导的、自我强化的转录检查点，广泛限制人类T细胞的激活、效应程序和分化。此外，我们鉴定出NR2F6扰动后T细胞因子1（TCF-1）相关读数中的背景依赖性变化，但未建立直接分子调控关系。总之，这些结果确立了NR2F6作为调控人类T细胞免疫的核心检查点，并使其成为免疫肿瘤学中引人注目的治疗靶点。

## 结果

### NR2F6限制CAR-T细胞在体外NSCLC模型中的功能

基于先前研究确定小鼠NR2F6是T细胞效应功能的转录抑制因子，以及其在人类肺癌微环境中的强烈诱导，我们假设NR2F6代表了CAR-T细胞在实体瘤中的关键内在限制。为模拟肿瘤相关的NR2F6诱导，我们在CAR-T细胞中强制NR2F6表达，导致CAR-T细胞效力严重受损（图1）。基于先前报道将NR2F6与非小细胞肺癌相关的临床未满足需求，我们采用了抗表皮生长因子受体（EGFR）CAR靶向A549肿瘤细胞。通过流式细胞术和免疫印迹分别确认了CAR-T细胞的成功生成和NR2F6过表达（图1A-1C）。值得注意的是，在CAR-T细胞生产过程中，NR2F6过表达显著降低了激活标记物（CD69和CD25）的水平，同时改变了激活相关抑制受体的表达，包括程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、淋巴细胞活化基因3（LAG-3）和T细胞免疫球蛋白黏蛋白域3（TIM-3），表明激活状态显著减弱（图1D）。在重组EGFR特异性再刺激时，NR2F6过表达CAR-T细胞表现出几乎完全丧失效应细胞因子产生（图1E）。一致的是，功能性障碍在系列体外杀伤实验中进一步得到证实，其中肿瘤细胞裂解缺陷随新肿瘤靶标再刺激轮次的增加而日益显著，与共培养上清中不断积累的细胞因子缺陷相符（图1F和1G）。

**图1 NR2F6限制CAR-T细胞在体外NSCLC模型中的功能**

显示完整图注

查看器

（A）用于CAR以及NR2F6过表达（橙色）或相应对照（灰色）的构建体示意图。
（B）流式细胞术确认CAR表达。（n = 6位供体，配对t检验）
（C）确认NR2F6过表达的免疫印迹。（代表n = 3位供体）
（D）CAR-T细胞生产结束时激活标记物（CD69和CD25）及激活相关抑制受体（PD-1、LAG-3和TIM-3）的流式细胞术表征。（n = 6位供体，配对t检验）
（E）经 Brefeldin A 和莫能菌素处理（再刺激后45分钟加入）后，通过1 μg/mL包被重组EGFR再刺激4小时的细胞内流式细胞术分析IL-2、IFN-γ和GZMB产生。（n = 6位供体，配对t检验）
（F）系列杀伤实验：CAR-T细胞与A549B2M?/? eGFP靶细胞以1:1的效应细胞对靶细胞（E:T）比例共培养。每48小时添加与初始接种数相同数量的新鲜A549B2M?/? eGFP细胞。肿瘤细胞杀伤通过每2小时的活细胞成像监测。
（G）Bioplex分析，测量每轮杀伤结束时、用新鲜肿瘤细胞再刺激前，共培养上清中IL-2、IFN-γ和GZMB浓度。（n = 7位供体）。每轮杀伤和Bioplex分析使用重复测量双因素方差分析，后接Holm-?ídák多重比较校正的事后检验。
所有数据表示为均值 ± SEM，并附带连接的个体供体数据点。n.s.，无显著性；?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001。

为严谨定义NR2F6的功能角色，我们还探索了NR2F6缺陷对CAR-T细胞的影响。然而，在这种设置下不预期功能益处，因为NR2F6在标准体外条件下仅弱诱导于对照CAR-T细胞，且内在抑制调控因子的持续丧失已知会因再刺激诱导的细胞死亡而带来技术限制（如PD-1等其他免疫检查点所述）。我们使用已建立的模型系统，采用CRISPR-Cas9介导的NR2F6敲除策略，允许富集修饰细胞。为此，我们设计了sgRNAs并首先在体外切割实验和强NR2F6表达的HEK293T细胞中进行了验证，随后将该系统转移到赋予嘌呤霉素抗性的慢病毒载体中。在Jurkat细胞中使用这种方法，我们确认NR2F6敲除可根据嘌呤霉素选择后的存活率间接评估，这是我们随后应用于原代人类T细胞的策略（图S1）。确实，NR2F6缺失导致CAR-T细胞存活率和扩增降低，因此未能改善体外肿瘤杀伤（图S2）。

### NR2F6作为一种可诱导的人类转录检查点发挥作用

为阐明NR2F6如何在慢性刺激下被诱导和维持，我们进行了启动子和表达分析（图2）。TRANSFAC分析鉴定出人类NR2F6启动子中多个预测的活化T细胞核因子（NFAT）、信号转导子和转录激活因子（STAT）以及视黄酸受体/视黄酸X受体（RAR/RXR）结合位点，表明NR2F6嵌入核心TCR反应和相关转录电路中（图2A）。与小鼠数据一致，实时定量PCR（RT-qPCR）显示多克隆TCR激活后NR2F6呈刺激强度依赖性上调，48小时达峰值（图2B和2C）。通过抗CD3抗体每两天重复TCR接触维持了NR2F6 mRNA在至少8天的升高，反映了其在TILs中的持续表达（图2D）。在Jurkat细胞中用近端NR2F6启动子进行荧光素酶报告基因分析表明，RAR和RXR的共表达可以激活NR2F6转录（图2E）。鉴于视黄酸是生理性RAR/RXR激动剂且在肿瘤微环境中丰富，这些发现表明该机制可能有助于慢性抗原暴露期间NR2F6的持续上调。

**图2 NR2F6作为一种可诱导的免疫检查点发挥作用，在体外慢性刺激期间持续表达**

显示完整图注

查看器

（A）人类NR2F6启动子的简化TRANSFAC分析，显示已描述和预测的转录因子结合位点。
（B-D）原代人类T细胞中NR2F6的RT-qPCR表达评估，在不同刺激背景下通过包被抗CD3和可溶性抗CD28抗体进行刺激。（B）在不同浓度抗CD3和抗CD28（如指定）刺激24小时后的表达（n = 3位供体，Pearson's r，log([anti-CD3]) vs. 平均NR2F6表达，及配对t检验）。（C）刺激至66小时的时间过程分析，使用10 μg/mL包被抗CD3和2 μg/mL可溶性抗CD28抗体。（n = 5位供体）。（D）每48小时使用10 μg/mL包被抗CD3和2 μg/mL可溶性抗CD28抗体重复刺激至多8天后的表达（n = 6位供体）。
（E）人类NR2F6近端启动子荧光素酶报告基因实验。Jurkat-TAg细胞共转染RARA、RXRA或空载体，以及启动子萤光素酶报告基因（RLU1）和对照报告载体pTK-Renilla-Luc（RLU2）。显示构建体（左）及RLU1/RLU2比值的定量（右）。（n = 5个重复，非配对t检验）
所有数据表示为均值 ± SEM，并附带连接的个体供体数据点。n.s.，无显著性；?p < 0.05，??p < 0.01

总之，这些发现将NR2F6定义为一个TCR诱导的转录检查点，由自我强化的调控电路维持，为其在肿瘤微环境中慢性抗原暴露下于TILs中持续上调提供了机制基础，并使NR2F6能够在慢性刺激环境（如肿瘤）中作为人类T细胞免疫的持久制动发挥作用。

### NR2F6广泛抑制人类T细胞激活和效应程序

在确立NR2F6作为人类T细胞的可诱导检查点后，我们接下来评估其抑制角色是否在人类细胞中进化保守。使用Jurkat报告细胞和原代CD3? T细胞（带慢病毒NR2F6过表达或CRISPR-Cas9介导的敲除，图S3），我们观察到NR2F6过表达一致减弱TCR驱动激活，而NR2F6缺失增强激活（图3和S4）。

**图3 NR2F6抑制TCR信号，导致T细胞激活降低**

显示完整图注

查看器

稳定NR2F6修饰的人类T细胞在选择和2周扩增后进行分析。NR2F6缺陷细胞用绿色表示，NR2F6过表达细胞用橙色表示。

（A）静息细胞和24小时再刺激后激活标记物CD69和CD25的流式细胞术表征（预门控在CD8? T细胞上），通过0.3125或5 μg/mL（分别为敲除或过表达细胞）包被抗CD3抗体进行再刺激。

代表性点图及定量分析（均值 ± 标准误，连同连接的各个供体数据点）如图 3A 所示（n = 4–15 名供体，配对 t 检验）。(B) 通过 5 μg/mL 包被于板上的抗 CD3 抗体进行 24 小时再刺激后的磷酸酪氨酸（p-Y）免疫印迹。免疫印迹（左侧）及其灰度定量（右侧）如图 3B 所示（n = 3 名供体，配对 t 检验）。(C–E) 静息状态下 NR2F6 敲除细胞及 4 小时再刺激后 NR2F6 过表达细胞的宏基因组 RNA 测序分析。(C) decoupleR 分析，展示各组推断的 T 细胞激活相关转录因子活性分布，基于从基因调控网络推导的富集评分（左侧），以及 NR2F6 敲除/过表达细胞与其各自对照之间活性变化（右侧），星号表示显著性。(D) 基于 NR2F6 敲除/过表达细胞与其各自对照之间（平均）倍数变化的排序基因列表，对"TCR 信号通路"KEGG 通路进行的基因集富集分析。富集图连同归一化富集评分（NES）和校正 p 值（padj）如图 3D 所示（NR2F6 敲除 n = 5 名供体；NR2F6 过表达 n = 4 名供体）。(E) 经 5 μg/mL 包被于板上的抗 CD3 抗体进行 4 小时再刺激后分选 CD8+ T 细胞的 ATAC-seq 分析。在差异可及性峰值区域进行了 MonaLisa 基序富集分析。对照与 NR2F6 过表达细胞之间 NFAT、AP-1 和 NF-κB 家族转录因子基序的富集差异如图 3E 所示，连同从 JASPAR 数据库获得的每个家族中失调最显著的基序。(n = 4 名供体)。(F–H) 抗 CD3 抗体再刺激后 NR2F6 过表达细胞核提取物中 NFAT、AP-1 和 NF-κB 活性的分析（每组 n = 3 名供体）。(F) 24 小时再刺激后核内 NFATc1 蛋白水平的免疫印迹分析。(G 和 H) EMSA 显示 (G) AP-1 及 (H) NF-κB 在 4 小时再刺激后的 DNA 结合活性。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。通过抗 CD3 抗体进行多克隆再刺激后，NR2F6 过表达降低了 CD69 和 CD25 的表面表达，而敲除则增强了这些标记（图 3A）。此外，过表达细胞在再刺激后酪氨酸磷酸化水平降低（图 3B）。通过 decoupleR 分析推断的转录因子活性显示，NR2F6 敲除细胞中 NFAT、活化蛋白 1（AP-1）和核因子 kappa 轻链增强子活化 B 细胞（NF-κB）活性显著增强，而过表达细胞则呈现相反的效应（图 3C）。基因集富集分析（GSEA）对京都基因与基因组百科全书（KEGG）"TCR 信号通路"的结果证实了这些发现，敲除细胞显示明显的基因富集，而过表达细胞则显示耗竭（图 3D）。这些发现进一步在多个分子层面得到了证实。对 NR2F6 过表达细胞进行 ATAC-seq 分析，结合对差异可及性基因组区域的 monaLisa 基序富集分析，显示 NFAT、AP-1 和 NF-κB 转录因子结合基序在对照细胞中可及性更高的区域更强富集。换言之，在 NR2F6 过表达条件下，这些调控元件的可及性降低，与相应转录程序活性降低一致（图 3E）。最直接的确证是在蛋白水平获得的。通过抗 CD3 抗体进行多克隆再刺激后，NR2F6 过表达细胞的 NFATc1 核内积累减少（图 3F），同时与 AP-1 和 NF-κB 共识序列的结合活性降低（图 3G 和 3H）。综上所述，这些数据提供了直接证据，表明 NR2F6 抑制 NFAT-、AP-1- 和 NF-κB 介导的信号通路。在功能上，NR2F6 过表达几乎完全阻断了白细胞介素-2（IL-2）和干扰素-γ（IFN-γ）的产生，这两种细胞因子此前已被证明在 murine T 细胞中分别由其启动子区域直接受 NR2F6 调控，同时还阻断了颗粒酶 B（GZMB）——T 细胞细胞毒性的核心介质。相反，NR2F6 敲除增加了这些效应输出。具体而言，NR2F6 过表达在短期（4 小时）再刺激后显著降低了所有这些细胞因子的胞内水平，并在 24 小时刺激后抑制了其向培养上清中的分泌，而 NR2F6 敲除则表现出相反的效果（图 4A 和 4B）。转录组分析证实了细胞毒性基因网络的广泛抑制，包括细胞毒性装置的主要成分（图 4C），KEGG 通路的 GSEA 突出了"细胞因子-细胞因子受体相互作用"、"JAK-STAT"和"趋化因子信号通路"的显著失调（图 4D 和 4E）。图 4 NR2F6 作为细胞因子表达和效应功能的负调控因子。完整说明：稳定改造的 NR2F6 修饰人 T 细胞在选择及两周扩增期后进行分析。NR2F6 缺失细胞以绿色表示，NR2F6 过表达细胞以橙色表示。(A 和 B) 抗 CD3 抗体再刺激后 IL-2、IFN-γ 和 GZMB 产生的分析。(A) 在 4 小时通过 5 μg/mL 抗 CD3 抗体再刺激后（加入布雷菲德菌素 A 和莫能菌素，再刺激后 45 分钟加入），以 CD8+ T 细胞为预筛选条件的胞内流式细胞术。(n = 4–8 名供体，配对 t 检验)。(B) 24 小时再刺激后（敲除细胞 0.3125 μg/mL，过表达细胞 5 μg/mL）上清中浓度的 Bio-Plex 分析。(n = 4–8 名供体，配对 t 检验)。数据以均值 ± 标准误表示，连同连接的各个供体数据点。(C–E) 静息状态下 NR2F6 敲除细胞及 4 小时再刺激后 NR2F6 过表达细胞的宏基因组 RNA 测序分析。(C) 热图展示 NR2F6 敲除/过表达细胞及其各自对照中细胞毒性相关基因的差异表达，使用（供体特异性）z 分数，并附 DESeq2 推导的 p 值表示表达变化的显著性。(D) 基于 NR2F6 敲除/过表达细胞与各自对照之间（平均）倍数变化的排序基因列表，对细胞因子（信号）和趋化因子相关 KEGG 通路的基因集富集分析。显示归一化富集评分（NES）和校正 p 值（padj）。(E) 细胞因子-细胞因子受体相互作用的富集图。(NR2F6 敲除 n = 5 名供体；NR2F6 过表达 n = 4 名供体)。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。值得注意的是，虽然 NR2F6 过表达对人 T 细胞激活和效应功能产生了深远的抑制作用，但 NR2F6 缺失仅产生了较为温和但一致增强的效果，这可能反映了基因敲除前 NR2F6 的诱导以及长期培养中的代偿性适应或强烈过表达的非生理效应。总之，在这些局限性之内，数据支持 NR2F6 作为人 T 细胞激活、细胞因子产生和细胞毒性相关程序的负调控因子。NR2F6 约束分化并以背景依赖方式调节 TCF-1 相关的功能性读数。由于激活状态与谱系命运紧密耦合，我们接下来询问 NR2F6 是否也塑造 T 细胞分化（图 5）。对 C-C 趋化因子受体 7（CCR7）/CD45RO 亚群的表型分析揭示，NR2F6 过表达有利于初始（CCR7高 CD45RO低）和中央记忆样（CCR7高 CD45RO高）群体，同时限制效应记忆和终末效应亚群（分别为 CCR7低 CD45RO高和 CCR7低 CD45RO低）（图 5A）。与此观察一致，GSEA 显示 NR2F6 过表达细胞中与 T 细胞分化相关的 KEGG 通路显著负富集，而 NR2F6 缺失时相同通路则显示相反的正富集（图 5B）。图 5 NR2F6 调节 TCF-1 相关的分化读数。完整说明：稳定改造的 NR2F6 修饰人 T 细胞在选择及两周扩增期后进行分析。NR2F6 缺失细胞以绿色表示，NR2F6 过表达细胞以橙色表示。(A) 以 CD8+ T 细胞为预筛选条件，对分化标记 CCR7 和 CD45RO 进行流式细胞术表征，并相应分类为初始 T 细胞（TN）、中央记忆 T 细胞（TCM）、效应/记忆 T 细胞（TEM）和终末效应 T 细胞（TTE）。代表性等高线图及定量分析如图 5A 所示（n = 8–12 名供体）。(B) 基于 NR2F6 敲除/过表达细胞与各自对照之间（平均）倍数变化的排序基因列表，对 T 细胞分化相关 KEGG 通路的基因集富集分析。显示归一化富集评分（NES）和校正 p 值（padj）。(C) TCF7 的 FPKM 归一化表达水平（均值 ± 标准误，连同连接的各个供体数据点）。(D 和 E) 抗 CD3 抗体（敲除细胞 0.3125 μg/mL 或过表达细胞 5 μg/mL）再刺激 24 小时后 TCF-1 的分析。(D) 核内 TCF-1 蛋白水平的免疫印迹以及 (E) 显示 TCF/LEF 结合活性的 EMSA（n = 2–4 名供体）。(F) 热图展示 NR2F6 敲除/过表达细胞及其各自对照中 TCF-1 调控基因的差异表达，使用（供体特异性）z 分数。(G) 基于 NR2F6 敲除/过表达细胞与各自对照之间（平均）倍数变化的排序基因列表，对 TCF-1 负调控基因的 GSEA 及相应富集图，附 NES 和校正 p 值（padj）。宏基因组 RNA 测序分析（B、C、F 和 G）在静息状态下 NR2F6 敲除及 4 小时再刺激后 NR2F6 过表达细胞中进行。(NR2F6 敲除 n = 5 名供体；NR2F6 过表达 n = 4 名供体)。聚焦于 TCF-1（TCF7）作为核心命运调控因子，我们发现 TCF7 转录本水平存在 NR2F6 依赖的中等但一致的变化，这在核内 TCF-1 蛋白丰度和 TCF/LEF 共识位点的 DNA 结合活性方面转化为明显的变化（图 5C–5E）。在所有层面上一致地，NR2F6 过表达增强了 TCF-1 活性，而 NR2F6 敲除则降低了它。相应地，几个已知的 TCF-1 靶基因出现了显著失调，尤其是对 TCF-1 负调控基因的影响，如 GSEA 所示（图 5F 和 5G）。为进一步研究 NR2F6 与 TCF-1 之间的关系，我们采用了 Jurkat 人白血病 T 细胞系模型系统。凝胶迁移率变动分析（EMSA）显示，NR2F6 过表达强烈抑制了内源性 TCF 的 DNA 结合活性（图 S5A 和 S5B），这与原代人 T 细胞中观察到的增强 TCF-1 活性形成对比。这些发现表明 NR2F6 以背景依赖方式调节 TCF-1 相关程序。与功能相互作用一致，NR2F6 过表达显著抑制了 TCF 反应元件驱动的荧光素酶报告活性（图 S5C），这与 NR2F6 在最小启动子元件上的已知转录抑制功能相符。综上所述，这些数据支持 NR2F6 以背景依赖方式调节 TCF 反应性读数，但未确立 NR2F6 与 TCF-1 的直接结合或 TCF-1 的直接调控，因为这些效应也可能通过 NFAT 或其他上游通路间接产生。讨论。鉴定新型免疫肿瘤学靶点是癌症免疫治疗的核心目标。本研究首次全面表征了 NR2F6 在原代人 T 细胞中的功能，并显示其作为 T 细胞免疫负调控因子的作用在进化上保守且在功能上不可替代，这与 murine 模型中的观察一致。利用原代人 T 细胞中的遗传扰动和一种在研的 CAR-T 细胞模型，我们证明 NR2F6 作为 T 细胞内在免疫检查点，协同抑制 TCR 信号传导、效应功能和分化。与 murine 模型系统中的先前工作一致，NR2F6 拮抗 NFAT- 和 AP-1 转录模块。扩展这些发现，我们的转录组、表观基因组和生物化学分析还揭示了 NF-κB 通路的失调作为 NR2F6 介导免疫抑制的附加机制。连同观察到的细胞因子、趋化因子和细胞毒性效应程序的改变，这些数据将 NR2F6 定位为调控人 T 细胞效应功能的关键转录检查点。我们的实验系统的几个方面需要考量。首先，NR2F6 缺失通过慢病毒递送 Cas9 和 sgRNA 加上抗生素选择来实现，虽然实现了稳健的调控和功能评估，但也引入了局限性。由于 NR2F6 在 T 细胞激活后迅速诱导，基因敲除前的初始表达可能部分掩盖表型。此外，长期培养可能允许代偿性适应的发生。连同体外 NR2F6 相对温和的诱导及其长期丢失导致的存活问题，这些因素可能共同导致了敲除中观察到的较过表达更为温和的效果。相反，强制过表达可能无法完全重现生理调控。然而，NR2F6 据报道在肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中强烈上调，支持了该模型的生物学相关性，尽管仍需在更多队列和癌症类型中进行验证。支持我们过表达数据功能意义的证据是，即使通过 CRISPR 激活对内源性 NR2F6 的温和上调（转录本水平约 1.4 倍），也与可检测的 T 细胞激活和效应细胞因子产生降低的趋势相关（图 S6）。虽然我们的分析主要关注经典与 CD8+ T 细胞相关的效应功能，但在 CD4+ T 细胞中也观察到了可比较的 NR2F6 依赖效应（图 S7），表明 NR2F6 广泛调控 CD4+ 和 CD8+ 亚群。鉴于 CD4+ T 细胞作为长期抗肿瘤免疫关键贡献者的认识日益增加，这一点尤为重要。因此，NR2F6 对 CD4+ T 细胞分化和功能状态的影响值得在后续研究中更详细地探讨。另一个尚存的局限性是 NR2F6 的孤儿受体状态仍未解决。

确定配体或调控NR2F6活性的微环境信号对于理解该通路如何参与肿瘤介导的免疫逃逸及其治疗可行性至关重要。从我们的数据中浮现的一项重要概念性突破是，NR2F6不仅可由TCR信号诱导，还能通过强化性调控回路维持其表达。启动子定位和报告基因实验表明，RAR/RXR可直接激活NR2F6启动子，为其在慢性抗原暴露下及人类肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中在RA-high肿瘤微环境内持续上调提供了潜在的机制解释。然而，我们的简化体外体系未考虑RAR/RXR的配体可用性，该假说需在更具生理相关性的环境中进行验证。尽管如此，此类强化性调控行为可能有助于解释肿瘤微环境（TME）信号如何建立NR2F6表达，随后即使上游刺激波动，该表达仍得以维持，从而在慢性刺激的T细胞中稳定化功能失调状态。

我们的CAR-T细胞数据凸显了该检查点的功能影响。强制表达NR2F6以模拟TILs中的高水平状态，显著损害了CAR-T细胞在反复肿瘤挑战下的激活、细胞因子产生和连续杀伤能力；而NR2F6缺失则未能改善肿瘤杀伤，且与存活率降低和扩增减少相关。这些效应可能反映再刺激诱导的细胞死亡、适应性下降或模型特异性因素，但均未经直接验证。这些发现表明，NR2F6有助于设定有效效应反应与过度刺激诱导的损耗之间的阈值，并强调了在工程化T细胞疗法中需要精心调度的NR2F6靶向策略。值得注意的是，抗CD19 CAR-T细胞的临床谱分析显示无应答者中NR2F6表达更高，进一步支持了NR2F6限制CAR-T细胞功能的概念。综合而言，这些观察结果要求对体内环境进行验证和延伸。植入肿瘤的免疫缺陷小鼠模型结合纵向流式细胞术分析，对于捕捉NR2F6依赖性的额外过程——如迁移、分化和真正的T细胞耗竭——将是必不可少的，而这些过程在体外无法完全重现。鉴于NR2F6缺失后细胞因子和趋化因子相关通路的显著失调，此类模型还可能揭示增强的肿瘤浸润，如此前在小鼠系统中观察到的那样。

NR2F6敲除在体内的效应幅度无法从现有数据中推断。然而，甚至可以说NR2F6敲除的有益影响在体内可能更为显著，因为预期肿瘤微环境将在对照CAR-T细胞组中诱导NR2F6表达，而体外观察到的存活率或适应性缺陷可能在生理条件下得到缓解。

从机制上看，NR2F6扰动与TCF-1相关读出物的背景依赖性变化相关。值得注意的是，此前的小鼠胸腺细胞和CAR-T细胞模型研究已证明NR2F6与TCF-1之间存在功能联系，支持了这些转录因子之间的关系。类似地，我们在人类T细胞中的数据也支持NR2F6与TCF-1相关转录程序之间存在功能联系，尽管未能完全阐明其潜在的分子机制。我们证实了NR2F6对TCF反应元件的调控，尽管该效应方向高度依赖于背景。特别值得注意的是，尽管我们的Jurkat荧光素酶实验显示了对TCF反应元件的调控，但这些实验并未证明NR2F6与TCF-1的直接相互作用或对TCF-1的直接调控。在原始人类T细胞中观察到的对TCF-1及其转录调控的影响仍可能代表NR2F6介导的持续NFAT抑制的次级后果，这是一个已被充分描述的调控联系，此前已由Seo等人审阅总结。因此，未来研究需要明确确定NR2F6是否也能在原始T细胞中直接调控TCF-1功能，以及如果可以，这种调控主要是通过对染色质可及性、共因子景观、直接蛋白质相互作用或上游信号转导的间接调控来实现的。

总之，我们的发现确立了NR2F6作为人类T细胞中整合信号调控的转录检查点，它抑制TCR驱动的转录和效应程序，从而在体外促进急性T细胞功能失调。

**研究局限性**

本研究存在一些局限性，在解释数据时应予以考虑。所有实验均在体外进行，因此未能捕捉到体内肿瘤相关抗原暴露的完整复杂性、组织特异性微环境信号、CAR-T细胞持久性或长期分化轨迹。因此，本研究展示了控制性刺激下的急性功能失调，但未能正式探讨真正的耗竭状态或确立体内相关性。其次，NR2F6调控依赖于在激活培养T细胞中的慢病毒策略。该流程导致NR2F6的早期诱导并允许代偿性适应，这可能是导致功能缺失表型比过表达更为温和的原因之一。相反，强制过表达可能超过生理水平，最好将其视为NR2F6活性升高的模型，而非对内源性调控的完整再现，尽管互补的CRISPRa实验支持NR2F6适度内源性上调的生物学影响。第三，NR2F6与TCF-1之间的机制联系尚未在分子水平上明确。TCF-1相关的发现并未证明NR2F6与TCF-1之间的直接相互作用；通过上游通路的间接调控仍然可能。最后，NR2F6仍是一个孤立的核受体，其生理配体及在人类肿瘤中调控其活性的微环境信号仍属未知，这代表了未来研究的重要方向。

**资源可用性**

**联系人**
请求进一步信息和资源请联系主要联系人Gottfried Baier（[e-mail]）。

**材料可用性**
本研究产生的所有独特/稳定试剂可从主要联系人处无限制获取。

**数据和代码可用性**
- 本研究产生的Bulk RNA-seq原始数据已存入基因表达综合数据库（GEO），登录号为GSE318203，自发表之日起公开可用。
- 本研究产生的Bulk ATAC-seq原始数据（对齐bam文件）已存入基因表达综合数据库（GEO），登录号为GSE336068，自发表之日起公开可用。
- 所有其他原始数据可在合理请求下从主要联系人处获取。
- 本文未报告任何原创代码。用于分析的公开代码在STAR Methods部分有详细说明。
- 重新分析本文所报告数据所需的任何附加信息可在请求下从主要联系人处获取。

**致谢**
我们感谢Viana Wille、Nina Posch和Friedrich Fresser博士（因斯布鲁克医科大学细胞遗传学研究所）提供的卓越技术协助。我们感谢支持本工作的所有资助机构，部分或全部包括：奥地利科学基金会（FWF；授予G.B.的基金-DOI 10.55776/P31383，授予K.S.的基金-DOI 10.55776/P34368，授予T.G.的基金-DOI 10.55776/PAT9292223，以及授予V.K.的基金-DOI 10.55776/T1292）；奥地利科学院（?AW）授予J.K.的DOC奖学金；以及欧洲研究理事会（ADG 786462，PoC 101054365，以及授予G.B.的PoC 101189004）。

**作者贡献**
概念化与设计：J.K.和G.B.设计了研究方案。G.B.监督了项目。实验与分析：J.K.构想、计划、执行并分析了所有实验，具体协助人员如下：D.F.协助了慢病毒NR2F6敲除实验的生成和分析（图3、4、5、S2和S3）；T.G.执行了核TCF-1、AP-1和NF-κB免疫印迹/电泳迁移率变异实验（图3G、3H、5D和5E）；N.Th.执行了BioPlex细胞因子分析和NFAT免疫印迹（图1G、2B、3F和S2H）；D.S.协助了NR2F6表达分析（图2C和2D）；I.H.协助了连续杀伤实验（图1F）；V.L.执行了体外Cas9切割验证实验并协助修订中慢病毒NR2F6过表达实验的生成（图3F–3H和S1B）；N.To.协助了慢病毒NR2F6过表达实验的生成和分析（图1、3、4和5）；T.S.协助了TRANSFAC启动子分析和Jurkat荧光素酶实验（图2A和2E）；K.S.协助了NR2F6表达分析（图2C）及HEK293T细胞中sgRNA验证（图S1C和S1D）。稿件撰写与批准：J.K.进行了数据可视化并制作了图表。J.K.和G.B.撰写了稿件初稿。所有作者阅读、批评性修订并批准了最终稿件。

**利益声明**
作者声明以下竞争性利益：V.K.、J.K.、K.S.、D.H.、D.W.和G.B.是免疫肿瘤学领域免疫相关靶点专利的发明人。

**生成式AI和AI辅助技术在稿件准备过程中的声明**
在本工作准备过程中，作者使用了Perplexity和ChatGPT5.0以改进措辞。在使用这些工具后，作者审阅并编辑了内容，并对出版物内容承担全部责任。

**STAR★方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| Alexa Fluor? 488抗人CD3抗体（克隆UCHT1） | BioLegend | RRID: AB_389310；Cat#300415 |
| Alexa Fluor? 488抗人CD45RO抗体（克隆UCHL1） | BioLegend | RRID: AB_528823；Cat#304212 |
| Alexa Fluor? 647抗人CD69抗体（克隆FN50） | BioLegend | RRID: AB_528871；Cat#310918 |
| Brilliant Violet 510?抗人CD8a抗体（克隆RPA-T8） | BioLegend | RRID: AB_2561942；Cat#301048 |
| FITC抗人/小鼠Granzyme B抗体（克隆GB11） | BioLegend | RRID: AB_2114575；Cat#515403 |
| InVivoMAb抗人CD3（克隆OKT3） | BioXcell | RRID: AB_1107632；Cat#BE0001-2 |
| InVivoMAb抗人CD28（克隆9.3） | BioXcell | RRID: AB_2687729；Cat#BE0248 |
| 小鼠单克隆抗HDAC1（克隆10E2） | Santa Cruz | RRID: AB_2118083；Cat#sc-81598 |
| 小鼠单克隆抗NFATc1（克隆7A6） | Santa Cruz | RRID: AB_2152503；Cat#sc-7294 |
| 小鼠单克隆抗NR2F6（克隆2H2B8） | ProteinTech | RRID: AB_2155653；Cat#60117-2-Ig |
| 小鼠单克隆抗磷酸酪氨酸（克隆4G10） | Cell Signaling | RRID: AB_3096295；Cat#96215 |
| 小鼠单克隆抗TCF-1（克隆A-79） | Santa Cruz | RRID: AB_1130027；Cat#sc-101170 |
| 小鼠单克隆抗β-actin（克隆C-11） | Santa Cruz | RRID: AB_630835；Cat#sc-1615 |
| Pacific Blue?抗人CD4抗体（克隆OKT4） | BioLegend | RRID: AB_571953；Cat#317424 |
| PE抗人CD279（PD-1）抗体（克隆EH12.2H7） | BioLegend | RRID: AB_940483；Cat#329906 |
| PE抗人IL-2抗体（克隆MQ1-17H12） | BioLegend | RRID: AB_315094；Cat#500307 |
| PE/Cyanine7抗人CD223（LAG-3）抗体（克隆11C3C65） | BioLegend | RRID: AB_2629753；Cat#369310 |
| PE/Cyanine7抗人CD45RA抗体（克隆HI100） | BioLegend | RRID: AB_10708879；Cat#304126 |
| PE/Cyanine7抗人IFN-γ抗体（克隆4S.B3） | BioLegend | RRID: AB_2123323；Cat#502528 |
| PerCP/Cyanine5.5抗人CD25抗体（克隆M-A251） | BioLegend | RRID: AB_2561979；Cat#356112 |
| PerCP/Cyanine5.5抗人CD366（Tim-3）抗体（克隆F38-2E2） | BioLegend | RRID: AB_2561934；Cat#345016 |

**生物样本**
白细胞去除袋/健康供体PBMC：因斯布鲁克大学医院血库，N/A

**化学试剂、肽和重组蛋白**
- Acridine Orange/Propidium Iodide染色：Biocat，Cat#F23001-LG
- BD GolgiPlug?蛋白转运抑制剂（含溴化氯胺酮）：BD Biosciences，Cat#555029
- BD GolgiStop?蛋白转运抑制剂（含莫能菌素）：BD Biosciences，Cat#554724
- 生物素标记重组EGFR：Creative Biolabs，Cat#CARD-LX025
- 牛血清白蛋白（BSA）：Sigma，Cat#A7906
- DMEM：PAN Biotech，Cat#P04-03500
- dNTPs：Biozym，Cat#331520
- EMSA稳定溶液D：Activ Motif，Cat#37488
- 乙二胺四乙酸（EDTA）：Thermo Fisher Scientific，Cat#J15694.AP
- 胎牛血清：Biowest，Cat#S1810-500
- 固定缓冲液：BioLegend，Cat#420801
- GoTaq G2 Hot Start聚合酶：Promega，Cat#M7401
- Halt?蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物：Thermo Fisher Scientific，Cat#78444
- HBSS：PAN Biotech，Cat#P04-34500
- 人重组IL-2：BioLegend，Cat#589102
- 细胞内染色通透性洗液缓冲液（10X）：BioLegend，Cat#421002
- 离子霉素：Sigma，Cat#I0634
- L-谷氨酰胺：PAN Biotech，Cat#P04-80050
- Lenti-X?浓缩剂：Takara，Cat#631232
- Lipofectamine 2000：Thermo Fisher Scientific，Cat#11668019
- Lymphopure：BioLegend，Cat#426202
- MgCl2：Promega，Cat#A351H
- 非必需氨基酸：Sigma，Cat#M7145
- 青霉素-链霉素：PAN Biotech，Cat#P06-07100
- peqGREEN DNA染料：Peqlab，Cat#732-2960
- 磷酸缓冲盐水（PBS）：Thermo Fisher Scientific，Cat#J62036.K3
- 佛波醇12,13-二丁酸酯：Sigma，Cat#P1269
- Polybrene：Sigma，Cat#TR-1003-G
- 嘌呤霉素：Sigma，Cat#P8833
- 重组化脓性链球菌Cas9核酸酶：IDT，Cat#1081059
- RIPA缓冲液：Sigma，Cat#R02789
- RPMI 1640：PAN Biotech，Cat#P04-17500
- SB415286：Selleckchem，Cat#S2729
- 丙酮酸钠：Sigma，Cat#S8636

**关键商业检测**
- Anti-Mouse检测模块：ProteinSimple，Cat#DM-0021
- 2–230 kDa分离模块：ProteinSimple，Cat#SM-W001
- 双缩脲酸（BCA）检测：Thermo Fisher Scientific，Cat#23227
- Bio-Plex Pro人细胞因子IL-2套装：Biorad，Cat#171-B5003M
- Bio-Plex Pro人细胞因子IFN-γ套装：Biorad，Cat#171-B5019M
- Cell Line Nucleofector?试剂盒：Lonza，Cat#VCA-1003
- 双荧光素酶报告实验：Promega，Cat#E1960
- Guide-it? sgRNA筛选试剂盒：Takara Bio，Cat#632639
- 人Granzyme B ProcartaPlex?单重试剂盒：Thermo Fisher Scientific，Cat#EPX01A-120
- 27–901LS柱及QuadroMACS分离器：Miltenyi Biotec，Cat#130-042-401和130-091-051
- MojoSortTM人CD3细胞分离试剂盒：BioLegend，Cat#480131
- Monarch PCR及DNA纯化试剂盒：New England Biolabs，Cat#T1030L
- NucleoSpin组织试剂盒：Macherey-Nagel，Cat#740952
- Omniscript RT试剂盒：Qiagen，Cat#205111
- RNeasy试剂盒：Qiagen，Cat#74016

**存档数据**
- NR2F6缺陷或NR2F6过表达的主要人T细胞Bulk RNA-Seq原始数据，通过慢病毒转导（CRISPR-Cas9或直接NR2F6整合）进行基因改造，随后经嘌呤霉素筛选和15天扩增。NR2F6-OE组使用5 μg/mL抗CD3抗体进行4小时多克隆再刺激。
本文，存档于基因表达综合数据库（GEO），登录号GSE318203

- NR2F6过表达的主要人T细胞的ATAC-Seq分析数据，通过慢病毒转导直接整合NR2F6生成，随后经嘌呤霉素筛选和15天扩增，之后进行CD8分选并使用5 μg/mL抗CD3抗体进行4小时多克隆再刺激。
本文，存档于基因表达综合数据库（GEO），登录号GSE336068

**实验模型：细胞系**
- A549B2M?/?：Abcam，RRID: CVCL_C3CC；Cat#ab286573
- A549B2M?/? eGFP：本文，N/A
- A549B2M?/? mCherry：本文，N/A
- HEK293T：Abcam，RRID: CVCL_0063；Cat#ab255449
- Jurkat-T：G.R.馈赠

Crabtree；斯坦福大学，CAN/A JurkatNTC 本文 N/A Jurkat NR2F6?/–（sgRNA2）本文 N/A Jurkat NR2F6?/–（sgRNA3）本文 N/A Jurkat CTRL?OE 本文 N/A Jurkat NR2F6?OE 本文 N/A Jurkat dCas9?VPR 本文 N/A
寡核苷酸
CRISPRa：对照crRNA池——假设靶序列：5′-GATACGTCGGTACCGGACCG-3′、5′-GTAACGCGAACTACGCGGGT-3′、5′-GTCGACGTTATTGCCGGTCG-3′、5′-GGAAACCTACGTCGACGAAT-3′；Dharmacon，货号U-009500–10–20
CRISPRa：靶向NR2F6启动子的crRNA池——靶序列：5′-GGCCGCCCTTATAAGGGCAT-3′、5′-CAGGGGTTAAGGCCCGAGCT-3′、5′-TTAAGGCCCGAGCTGGGCGA-3′、5′-GAGGAAGCAAACACAATCTA-3′；Dharmacon，货号P-003423-01-0020
CRISPR KO：对照sgRNA（安全港，PPP1R12C，内含子1）——靶序列：5′-CGTTGCCAGTCTCGATCCGC-3′；GeneScript，定制合成
CRISPR KO：靶向NR2F6的sgRNAs——靶序列：sgRNA1：5′-TACGGTGTCTTCACCTGCGA-3′；sgRNA2：5′-GTACTGCGCCCGCACATACT-3′；sgRNA3：5′-AGGTGTAGCTGAGGTTGCGG-3′；Dharmacon，货号SG-003423–01/02/03
CRISPR KO：扩增NR2F6外显子1的PCR引物——正向：5′-ACGAACGGCGTGGACAAG-3′；反向：5′-CCAAGTTCCACGTTCGATTCC-3′；扩增产物跨越sgRNA1/sgRNA3切割位点；Eurofins，定制合成
CRISPR KO：扩增NR2F6外显子3的PCR引物——正向：5′-CGATCCTCCCATTAGCCTTC-3′；反向：5′-TTCCCTGTCCCTTGAGGTCT-3′；扩增产物跨越sgRNA2切割位点；Eurofins，定制合成
EMSA AP-1保守结合位点寡核苷酸 5′-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3′；Eurofins，定制合成
EMSA NF-κB保守结合位点寡核苷酸 5′-CTGGGGACTTTCCGCT-3′；Eurofins，定制合成
EMSA TCF/LEF保守结合位点寡核苷酸（TOP）5′-TGTTAAGATCAAAGGGTTTAAGATC-3′；Eurofins，定制合成
EMSA 突变的TCF/LEF保守结合位点寡核苷酸（FOP）5′-TGTTAAGAAAAAAGGGTTTAAGATC-3′；Eurofins，定制合成
RPL13A的TaqMan基因表达引物与探针；Thermo Fisher/Applied Biosciences，Assay ID: Hs04194366_g1_VIC_MGB
NR2F6的TaqMan基因表达引物与探针；Thermo Fisher/Applied Biosciences，Assay ID: Hs00172870_m1_FAM_MGB
重组DNA
hEF1a-Puro R:T2A:Cas9-U6-sgRNA(NTC)慢病毒质粒；Horizon Discovery，货号GSGC11963
hEF1a-Puro R:T2A:Cas9-U6-sgRNA2(NR2F6)慢病毒质粒；Horizon Discovery，货号GSGH11935-247640844
hEF1a-Puro R:T2A:Cas9-U6-sgRNA3(NR2F6)慢病毒质粒；Horizon Discovery，货号GSGH11935-247620068
LentiArt? 病毒包装质粒；Creative Biolabs，货号CART-027CL
lenti-EF1a-dCas9-VPR-Puro；由Kristen Brennand惠赠；Addgene #99373
NR2F6启动子（相对于TSS的bp ?2145至?1）-荧光素酶报告基因质粒；本文，N/A
pCDCAR1-抗EGFR-CAR（西妥昔单抗）h(41BB-CD3ζ)慢病毒质粒；Creative Biolabs，货号CAR-MZ007
pCDH-CMV-mCherry-T2A-puro慢病毒质粒；由K. Oka惠赠；Addgene #72264
pEF1a-(空载体)-Neo哺乳动物表达质粒；本文，N/A
pEF1a-RARA-Neo哺乳动物表达质粒；本文，N/A
pEF1a-RXRA-Neo哺乳动物表达质粒；本文，N/A
pEF1a-NR2F6-Neo哺乳动物表达质粒；本文，N/A
pEF1a-NR2F6C111S-Neo哺乳动物表达质粒；本文，N/A
pEF1a-TCF7亚型4-Neo哺乳动物表达质粒；本文，N/A
pGL4.49[luc2P/TCF-LEF/Hygro]报告基因质粒；Promega，货号9PIE461
pLV[Exp]-EF1A>ORF填充元件:IRES:Puro慢病毒质粒；本文，VectorBuilder，Vector ID: VB241126-1331hgg
pLV[Exp]-EF1A>hNR2F6[NM_005234.4]:IRES:Puro慢病毒质粒；本文，VectorBuilder，Vector ID: VB241127-1225nsn
pLVX-EGFP-IRES-Puro慢病毒质粒；由R. Sobol惠赠，见Fang等描述；Addgene #128652
软件与算法
decoupleR（v2.8.0）；Badia等，N/A
DESeq2（v1.42.1）；Love等，N/A
FlowJo（v10.7.2.）；BD Biosciences，N/A
GraphPad Prism（v10.2.3）；GraphPad Software, LLC，N/A
Incucyte2022B分析软件；Sartorius，N/A
monaLisa（v1.16.0）；Machlab等，N/A
R（v4.3.3.）；R Foundation for Statistical Computing，N/A
其他
BTX T820 Electro Square Porator；ITC Biotech，N/A
DS-11分光光度计；DeNovix，N/A
FACSCanto II（4-2-2配置）；BD Biosciences，N/A
GelDoc Go凝胶成像系统；Bio-Rad，N/A
Jess自动化Western系统；Proteinsimple，N/A
PHERAstar FS酶标仪；BMG LABTECH，N/A
Thermo Neon? NxT电穿孔仪；Thermo Fisher Scientific，N/A

打开新标签页中的表格
实验模型与研究参与者详情
原代细胞培养
原代人T细胞由健康供者经因斯布鲁克大学医院血库获得，方法如方法细节部分所述。细胞来源于常规献血中剩余的血液材料，所有供者均已就剩余材料用于研究目的提供知情同意。未提供任何可识别的患者或供者数据。因此，并依照机构政策，无需额外的伦理审批。完全匿名化使无法考虑性别或年龄，这限制了对性别相关效应的评估，尽管供者代表了非系统性的随机样本。总共研究了来自35名不同供者的样品，每个实验所用供者数量见相应图注。由于本研究使用体外原代细胞进行机制分析，且仅在供者内进行比较，因此未进行实验组分配。
细胞培养于cRPMI中，即RPMI 1640（PAN Biotech, P04-17500），补充10%热灭活的FBS（Biowest, S1810-500）、100 U/mL青霉素/100 μg/mL链霉素（PAN Biotech, P06-07100）、2 mM L-谷氨酰胺（PAN Biotech, P04-80050）、1 mM丙酮酸钠（Sigma, S8636）以及1×非必需氨基酸（Sigma, M7145）。

细胞系
Jurkat-TAg细胞（由G.R. Crabtree惠赠，斯坦福大学）在cRPMI中培养。该细胞系源于一名14岁男性患者的人CD4+ T-ALL。然而，由于其主要用于方法验证并支持原代T细胞的发现，因此不会限制研究的普遍性。
A549 B2M?/?细胞（Abcam, ab286573）在补充10% FBS、100 U/mL青霉素与100 μg/mL链霉素的Ham's F-12K（Kaighn's）培养基（Thermo Fisher Scientific, 21127030）中培养（下文简称F12K++）。表达EGFP或mCherry的衍生细胞系通过用pLVX-EGFP-IRES-puro（由R. Sobol惠赠，Addgene #128652，见Fang等描述）或pCDH-CMV-mCherry-T2A-puro（由K. Oka惠赠，Addgene #72264）分别进行稳定转导而产生。A549细胞源于一名58岁男性患者的人肺腺癌肿瘤。由于这些细胞仅作为肿瘤靶细胞使用，并非本研究的主要对象，因此其特定背景可能产生的影响被认为是可忽略的。
在本研究过程中，这些细胞系未经过鉴定或支原体污染检测。

方法细节
细胞计数
使用LUNA自动细胞计数器（Logos Biosystems）配合吖啶橙/碘化丙啶染色（Biocat, F23001-LG）评估细胞数量和活力。

T细胞分离
通过密度离心从健康供者的白细胞减量锥（LRC）中分离外周血单个核细胞（PBMC）。LRC用含2 mM EDTA的HBSS（PAN Biotech, P04-34500）冲洗，分层于Lymphopure溶液（BioLegend, 426202）上，室温（RT）下以800 rcf离心30分钟，无制动。收集PBMC，用HBSS/2 mM EDTA洗涤，并基于制造商说明，使用MojoSort人CD3分离试剂盒（BioLegend, 480131）结合LS柱和QuadroMACS分离器（Miltenyi Biotec, 130–042–401及130–091–051）通过阴性选择纯化泛T细胞。根据各实验设置所示，可选地，使用MojoSort人CD8分离试剂盒（BioLegend, 480129）类似地通过阴性选择从泛T细胞中进一步纯化CD8+ T细胞。

NR2F6启动子和TCF/LEF反应元件荧光素酶实验
使用BTX T820 Electro Square Porator（ITC Biotech），在优化条件下（200 μL RPMI中1 × 10^7个细胞，450 V/cm，五次99 ms脉冲）通过电穿孔瞬时转染Jurkat-TAg细胞。
为测定NR2F6启动子活性，将15 μg位于pEF1a-Neo中的人RARA/RXRA表达构建体（或空载体，带有所示标签）与人近端NR2F6启动子驱动的荧光素酶报告基因（15 μg）共转染，并加入pTK-Renilla-Luc（0.3 μg；Promega）用于归一化。
为测定TCF/LEF反应元件活性，将15 μg克隆于pEFa-Neo中的HA标签人TCF7（亚型4，显性负性）或NR2F6表达构建体（野生型或DNA结合缺陷的C111S突变体）及相应的空载体对照，与10 μg的TOP或FOP TCF/LEF反应元件驱动的荧光素酶报告基因质粒（Promega, 9PIE461）共转染。为进行归一化，所有转染均加入0.1 μg的pTK-Renilla-Luc（Promega）。细胞用50 ng/mL 12,13-二丁基酯佛波醇和500 ng/mL伊诺霉素（PdBu/iono；Sigma, P1269和I0634）刺激过夜。在指示处，细胞用7 μM的GSK抑制剂SB415286（Selleckchem, S2729）处理，直接加入培养基中。
使用Dual-Luciferase报告基因检测试剂盒（Promega, E1960）在PHERAstar FS酶标仪（BMG LABTECH）上量化荧光素酶活性。

稳定CRISPR-Cas9介导的NR2F6敲除设计
使用三种预先设计的sgRNA靶向NR2F6：sgRNA1（靶序列：5′-TACGGTGTCTTCACCTGCGA-3′，外显子1，正向链）、sgRNA2（靶序列：5′-GTACTGCGCCCGCACATACT-3′，外显子3，反向链）和sgRNA3（靶序列：5′-AGGTGTAGCTGAGGTTGCGG-3′，外显子1，反向链）。对照sgRNA包括非靶向对照（NTC；假设靶序列：5′-GCTCTCGTACGGCGCGTATC-3′）（均来自Dharmacon；SG-003423–01/02/03）或靶向PPP1R12C的安全港（SH）sgRNA（靶序列：5′-CGTTGCCAGTCTCGATCCGC-3′，内含子1），使用Benchling设计。使用Cas-OFFinder验证sgRNA特异性。

体外切割实验
按照制造商说明使用NucleoSpin Tissue试剂盒（Macherey-Nagel, 740952）从CD3+ T细胞中分离基因组DNA（gDNA），并用DeNovix DS-11分光光度计测定DNA浓度。为制备DNA切割模板，用200 ng gDNA扩增分别被相应sgRNA靶向的NR2F6基因组区域。PCR使用GoTaq G2 Hot Start聚合酶及相应缓冲液、2 mM MgCl2（均来自Promega，M7401、M891A和A351H）和200 nM dNTPs（Biozym, 331520）进行。使用的引物对为：靶向被sgRNA1和sgRNA3切割的外显子1区域的5′-ACGAACGGCGTGGACAAG-3′与5′-CCAAGTTCCACGTTCGATTCC-3′（638 bp扩增产物），以及靶向被sgRNA2切割的外显子3区域的5′-CGATCCTCCCATTAGCCTTC-3′与5′-TTCCCTGTCCCTTGAGGTCT-3′（773 bp扩增产物）（均来自Eurofins Genomics）。PCR循环条件为：95°C初始变性2分钟，随后35个循环，每循环95°C 45秒、62°C 30秒、72°C 60秒，最后72°C延伸5分钟。PCR产物使用Monarch PCR & DNA Cleanup试剂盒（New England Biolabs, T1030L）纯化，并在15 μL反应中加入100 ng纯化的模板DNA、250 ng Cas9核酸酶、0.67 μM靶特异性或SH sgRNA、1× Cas9反应缓冲液和1× BSA（均来自Takara Bio, 632639），于37°C孵育60分钟进行体外切割。反应通过加热至80°C 5分钟终止，切割的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分析，并使用peqGREEN DNA染料在GelDoc Go成像系统（Bio-Rad）上可视化。

在HEK293T细胞中验证靶向NR2F6的sgRNAs
HEK293T细胞（Abcam, ab255449）在补充10% FBS（Biowest, S1810-500）、100 U/mL青霉素/100 μg/mL链霉素（PAN Biotech, P06-07100）和2 mM L-谷氨酰胺（PAN Biotech, P04-80050）的DMEM（PAN-Biotech, P04-01500）中培养。通过将重组溶血链球菌Cas9核酸酶（IDT, 1081059，带NLS-和6× His标签）与靶向NR2F6或SH对照的sgRNA以1:2.5 M摩尔比（90 pmol Cas9，225 pmol sgRNA）在25°C孵育20分钟来组装Cas9-sgRNA核糖核蛋白（RNP）复合物。使用Amaxa电穿孔通过Cell Line Nucleofector?试剂盒（Lonza, VCA-1003）和Q-001程序递送RNP。在电穿孔后24小时通过全细胞裂解液中NR2F6蛋白水平的免疫印迹分析评估敲除效率。

慢病毒NR2F6敲除、NR2F6过表达与CAR表达
使用EF1α驱动的Cas9-T2A-嘌呤霉素及U6驱动的靶向NR2F6的sgRNA（sgRNA2或sgRNA3）或非靶向对照实现NR2F6敲除（KO）（均来自Dharmacon，GSGH11935-247640844、GSGH11935-247620068和GSGC11963）。使用EF1α驱动的NR2F6或编码β-半乳糖苷酶（aa 2–83）的对照构建体，通过IRES连接至嘌呤霉素抗性，产生稳定的NR2F6过表达（OE）（VectorBuilder，VB241126-1331hgg和VB241127-1225nsn）。CAR表达采用第二代EGFR特异性构建体，包含由西妥昔单抗衍生的scFv、CD8铰链区和跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域及CD3ζ信号结构域（Creative Biolabs，CAR-MZ007）。
第三代自我失活的慢病毒由HEK293T细胞按照他人先前描述的方法生产。简要来说，在100 mm组织培养处理培养皿中，将4–5 × 10^6个HEK293T细胞接种于补充10% FBS（Biowest, S1810-500）、100 U/mL青霉素/100 μg/mL链霉素（PAN Biotech, P06-07100）和2 mM L-谷氨酰胺（PAN Biotech, P04-80050）的DMEM（PAN Biotech, P04-03500）中。在70–90%汇合度时，在无抗生素培养基中使用第三代慢病毒包装质粒（Creative Biolabs, CART-027CL；0.9 pmol pHELP1、1.5 pmol pHELP2、1.3 pmol pHELP3）连同2.25 pmol转移质粒进行转染。质粒在1.5 mL Opti-MEM（Thermo Fisher Scientific, 31985062）中稀释。同时，将Lipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific, 11668019）按DNA（μg）:Lipofectamine（μL）=1:1.3–1.6的比例在Opti-MEM中预稀释，然后以1:1与DNA混合液混合，在室温下孵育20–30分钟后逐滴（总计3 mL）加至细胞。6–18小时后更换培养基，转染后最多收集60小时的病毒上清，通过离心（500 rcf，10分钟，4°C）澄清，并用0.45 μm醋酸纤维素滤器（Thermo Fisher Scientific, 10009230）过滤。使用Lenti-X?浓缩剂（Takara, 631232）按3:1的上清与试剂比例浓缩慢病毒颗粒（首次收获过夜，二次收获≥3小时），随后离心（1500 rcf，45分钟，4°C）。病毒沉淀在RPMI中重悬至原体积的1/100，立即使用或冷冻保存。
对于稳定遗传修饰，在第0天使用αCD3/αCD28 Dynabeads（Thermo Fisher Scientific, 11132D）激活CD3+ T细胞。24小时后（第1天），在polybrene（8 μg/mL；Sigma, TR-1003-G）存在下进行转导。从第3–5天起用嘌呤霉素（2.5 μg/mL；Sigma, P8833）筛选转导细胞，随后去除磁珠并扩增直至第16天。培养连续维持在补充10 ng/mL IL-2（BioLegend, 589102）的cRPMI中，每2–3天更换一次并将细胞密度调节至0.5–1 × 10^6个细胞/mL。
对于同时调控NR2F6并表达CAR，细胞用两种载体同时共转导。第14天，通过基于重组EGFR的MACS，使用MS柱和OctoMACS分离器（Miltenyi, 130–042–201及130–042–109）根据制造商指示方案富集CAR+细胞。所有步骤均在4°C的CAR缓冲液（PBS、2 mM EDTA、2% BSA）中进行。简要而言，经15分钟封闭后，细胞用生物素化EGFR（0.5 μg/mL；Creative Biolabs, CARD-LX025）标记20分钟，再与抗生物素微珠（每10^6个细胞2.5 μL；Miltenyi, 130–090–485）共孵育，进行磁分离并收集阳性部分。通过流式细胞术确认分选纯度。

细胞随后扩增至第22-23天。为生成NR2F6敲除及过表达的Jurkat-TAg衍生细胞系（JurkatNTC、JurkatNR2F6?/–（sgRNA2）、JurkatNR2F6?/–（sgRNA3）、JurkatCTRL?OE和JurkatNR2F6?OE），类似于原代T细胞的操作，在8 μg/mL多聚鸟氨酸的存在下对这些细胞进行转导，并持续用1 μg/mL嘌呤霉素进行筛选。

CRISPRa介导的内源性NR2F6诱导

CRISPR激活（CRISPRa）通过使用催化活性缺失的Cas9核酸酶（dCas9）与VP64-p65-Rta（VPR）转录激活子复合物融合，并配合靶向NR2F6启动子区域或非靶向对照（NTC）序列的gRNAs来完成。由EF1α启动子驱动的dCas9-VPR构建体，通过P2A切割位点与嘌呤霉素抗性盒相连（由Kristen Brennand赠送，Addgene质粒#99373），通过慢病毒转导稳定导入细胞，随后进行嘌呤霉素筛选。之后，根据厂家说明，使用Thermo Neon?转染系统（Thermo Fisher Scientific，N10096）将0.45 μM gRNAs电穿孔至细胞中。

gRNAs通过将tracrRNA（Dharmacon，U-002005-50）与crRNAs以1:1摩尔比退火生成：在95°C变性5分钟后，缓慢冷却至室温。使用靶向NR2F6启动子的四种crRNA混合物（Dharmacon，P-003423-01-0020；靶序列：5′-GGCCGCCCTTATAAGGGCAT-3′、5′-CAGGGGTTAAGGCCCGAGCT-3′、5′-TTAAGGCCCGAGCTGGGCGA-3′和5′-GAGGAAGCAAACACAATCTA-3′）或四种NTC crRNAs（Dharmacon，U-009500–10–20；假设靶序列：5′-GATACGTCGGTACCGGACCG-3′、5′-GTAACGCGAACTACGCGGGT-3′、5′-GTCGACGTTATTGCCGGTCG-3′和5′-GGAAACCTACGTCGACGAAT-3′）。

对于原代人类T细胞，慢病毒转导和嘌呤霉素筛选操作类似于上述CRISPR介导的敲除或稳定过表达方案。在第17天前扩增后，用固定在培养板上的抗CD3抗体（1 μg/mL）刺激细胞以增强dCas9-VPR表达，24小时后进行gRNAs电穿孔。

对于JurkatdCas9?VPR细胞，在慢病毒转导后、电穿孔gRNAs之前，持续以1 μg/mL嘌呤霉素进行筛选。

流式细胞术

流式细胞术在FACSCanto II（4-2-2配置；BD Biosciences）上进行，操作如前所述。简言之，将细胞用活/死染料（BD Biosciences，65–0865–14）以1:2000稀释于HBSS中，在室温下孵育10分钟，然后在4°C用以下抗体（均为1:50；BioLegend）进行表面染色20分钟：CD3-AF488（300415）、CD4-Pacific Blue（317424）、CD8-BV510（301048）、CD25-PerCP-Cy5.5（356112）、CD45RA-PE-Cy7（304126）、CD45RO-AF488（304212）、CD69-AF647（310918）、LAG-3-PE-Cy7（369310）、PD-1-PE（329906）和TIM-3-PerCP-Cy5.5（345016）。

对于胞内细胞因子检测，在刺激后45分钟加入布雷菲尔德A和莫能菌素（GolgiPlug/GolgiStop；1:1000/1:1500；BD Biosciences，555029 & 554724），随后固定细胞30分钟（BioLegend，420801），所有后续步骤均在透化/洗涤缓冲液（BioLegend，421002）中进行，用抗体混合物（表面+胞内）孵育20分钟，包括granzyme B-FITC（515403）、IFN-γ-PE-Cy7（502528）和IL-2-PE（500307）。

对于使用生物素化重组EGFR（rEGFR；Creative Biolabs，CARD-LX025）检测CAR，所有步骤均在CAR缓冲液（PBS，2% BSA，2 mM EDTA）中进行，抗体混合物中加入1 μg/mL rEGFR，随后用BV421偶联的链霉亲和素（BioLegend，405226）染色20分钟。

数据使用FlowJo v10.7.2分析；除另有说明外，分析前对活细胞、淋巴细胞（FSC-A vs. SSC-A）和单个细胞（FSC-A vs. FSC-H或FSC-W）进行预门控。

(CAR-)T细胞体外再刺激

使用固定在培养板上的抗CD3抗体（克隆OKT3；Bio-X-Cell，BE0001-2；在PBS中过夜包被）和多价可溶性抗CD28抗体（克隆9.3；Bio-X-Cell；BE0248）对T细胞进行多克隆刺激，浓度如指定。CAR介导的刺激在链霉亲和素包被的平底96孔板中进行（20 μL 10 μg/mL链霉亲和素于无菌水中；Thermo Fisher Scientific，21125；室温干燥），在4°C加入生物素化重组EGFR（1 μg/mL；Creative Biolabs，CARD-LX025）孵育20分钟后再接种CAR-T细胞。在指定条件下，Jurkat-TAg细胞（或衍生细胞）用50 ng/mL佛波醇12,13-二丁酸酯和500 ng/mL离子霉素（PdBu/iono；Sigma，P1269和I0634）刺激，直接加入培养基中。

CAR-T细胞杀伤实验

A549B2M?/? eGFP或A549B2M?/? mCherry靶细胞（5 × 10^5个）在加入效应细胞前12-16小时接种于96孔板中，效应细胞与靶细胞比例为1:1（200 μL cRPMI）。48小时后用新鲜培养基替换100 μL含肿瘤细胞的上清液（均为三复孔）。使用Incucyte SX5系统（Sartorius）通过活细胞成像监测靶细胞杀伤。在10×放大倍数下采集荧光图像（GFP或mCherry，每孔4个视野，每2小时一次）。使用Incucyte 2022B软件通过总积分强度量化荧光值，使用预定义的分割参数（Surface Fit，阈值为1校准单位；启用边缘分裂；最小面积5 μm2）。在指定条件下，收集上清液进行Bio-Plex分析，细胞收获后进行流式细胞术。

RT-qPCR与批量RNA测序

使用RNeasy试剂盒（Qiagen，74016）按厂家说明提取总RNA。使用Omniscript RT试剂盒（Qiagen，205111）将提取的RNA逆转录为互补DNA（cDNA）。具体而言，将提取的RNA与以下试剂混合，最终反应体系为40 μL，包含1× RT缓冲液、每种dNTP 0.2 μM、逆转录酶0.1 U/μL（均取自试剂盒）、oligo-dT 15引物20 pg/μL（Promega，C1101）、随机六核苷酸引物20 pg/μL（Promega，C1181）和核糖核酸酶抑制剂4 U/μL（Promega，N2511）。反应在37°C孵育1小时后，在95°C热灭活6分钟。

基于TaqMan的逆转录定量PCR（RT-qPCR）使用LUNA Universal Probe qPCR Master Mix（NEB，3004）按前述方法进行，使用以下引物：RPL13A（Hs04194366_g1_VIC_MGB_PL）和NR2F6（Hs00172870_m1_FAM_MGB）（均取自Thermo Fisher Scientific/Applied Biosciences）。反应在7500 Fast Real-Time PCR仪（Applied Biosystems）上进行，初始变性（95°C，60秒）后进行40个循环的变性（95°C，15秒）和延伸（60°C，30秒）。

批量RNA-Seq文库使用非链特异性poly(A)富集方案制备（Novogene，PT042）。简言之，使用连接poly-T寡核苷酸的磁珠从总RNA中选择性捕获mRNA。片段化后，进行两步cDNA合成：首先使用随机六核苷酸引物进行第一链合成，随后进行第二链合成。然后通过一系列步骤构建文库，包括末端修复、加A尾、接头连接、大小筛选、扩增和纯化。为确保质量，使用Qubit和实时PCR进行定量，利用生物分析仪评估大小分布。文库在Novogene使用Illumina NovaSeq X Plus平台（双端测序，150 bp；每样本≥9 GB）进行测序。

reads使用fastp进行质量过滤，使用HISAT2（v2.2.1）比对至人类参考基因组（GRCh38/hg38）。原始计数限定为蛋白编码基因，并预过滤保留所有样本中总计数≥10的特征。差异表达分析使用DESeq2（v1.42.1）进行，以基因型为主要变量，供体效应（对于NR2F6过表达还包括CD4:CD8比值）作为协变量。热图使用rlog转换数据进行可视化（显示Z分数表达值——对于NR2F6敲除按供体显示）。使用fgsea（v1.28.0）对按log2倍数变化排序的基因进行GSEA分析，使用选定的KEGG通路或自定义TCF-1靶基因集。使用decoupleR（v2.8.0）结合CollecTRI人类转录因子网络推断转录因子活性，仅考虑包含≥5个基因的转录因子-靶基因集，并从DESeq2的Wald检验统计量中推导基因型对比。数据可视化使用ggplot2（v3.5.1）和pheatmap（v1.0.12）完成。

ATAC-seq处理、差异可及性和motif富集分析

转座酶可及染色质测序（ATAC-Seq）文库由GENEWIZ（AZENTA Life Sciences）制备，在Illumina平台上测序（2 × 150 bp）。使用Trimmomatic（v0.38）进行接头修剪和质量过滤。reads使用Bowtie2比对至人类参考基因组（hg38）。使用SAMtools（v1.9）过滤比对结果，保留主要比中且MAPQ ≥30的reads。使用Picard（v2.18.26）去除PCR和光学重复reads。在线性分析前排除线粒体reads和比对到未定位contigs的reads。

使用MACS2（v2.1.2）鉴定开放染色质区域，在有可用黑名单区域时将其排除。在每种条件下将生物学重复的peaks合并，保留至少在该组66%样本中存在的peaks。然后将各条件特异性的peak集合并生成共识peak集，并在所有样本中定量reads计数。使用DiffBind评估NR2F6 OE与CTRL条件之间的差异染色质可及性，差异显著peak定义为FDR ≤0.05。

使用monaLisa（v1.16.0）对显著差异peak（FDR <0.05）进行转录因子（TF）motif富集分析。Peaks限定在标准染色体上，并调整为中心对称的200 bp区域。使用BSgenome.Hsapiens.UCSC.hg38提取基因组序列（hg38）。从JASPAR2022获取转录因子motif并转换为位置权重矩阵。根据NR2F6 OE与CTRL之间的差异可及性，基于log2倍数变化对peaks进行分类（CTRL富集：log2FC < ?0.5；NR2F6 OE富集：log2FC > 0.5）。分别在每个类别中计算motif富集。差异motif富集定义为NR2F6 OE富集与CTRL富集peaks之间monaLisa log2富集分数的差值（OE ? CTRL），正值表示motif在NR2F6 OE相关开放区域优先富集，负值表示在CTRL相关区域富集。选定的转录因子家族，包括NFAT、NF-κB和AP-1，在火山图中可视化motif富集对比及在CTRL或NR2F6 OE中富集的相应调整p值。

Western blot与EMSA

全细胞裂解液（WCL）在RIPA缓冲液（Sigma，R02789）中加入1× Halt蛋白酶/磷酸酶抑制剂和5 mM EDTA（Thermo Fisher Scientific，78444）制备，在冰上裂解30分钟并间歇涡旋，然后通过离心（21,000 rcf，15分钟，4°C）收集含蛋白的上清液。使用标准双缓冲液方法制备核提取物（NE）：细胞沉淀（9,500 rcf，1分钟），用预冷PBS洗涤，重悬于300 μL缓冲液1（10 mM HEPES pH 7.9，10 mM KCl，0.1 mM EDTA，0.1 mM EGTA，1 mM DTT，0.5 mM PMSF）中冰上放置15分钟；加入20 μL 10% NP-40后涡旋并离心（2,350 rcf，5分钟）以破坏细胞膜但不破坏核膜。将上清液（胞质组分）冷冻保存，核沉淀用缓冲液1洗涤两次（2,350 rcf，5分钟），重悬于缓冲液2（20 mM HEPES pH 7.9，0.4 M NaCl，1 mM EDTA，1 mM EGTA，1 mM DTT，1 mM PMSF）中振荡孵育30分钟。离心后（13,500 rcf，10分钟）收集含核蛋白的上清液。使用BCA测定法（Thermo Fisher Scientific，23227）在PHERAstar FS酶标仪（BMG LABTECH）上测定蛋白浓度。

Western blot分析使用Jess Simple Western系统（ProteinSimple）按厂家说明进行，或按前述方法通过常规SDS-PAGE和免疫印迹完成。简言之，裂解液与SDS上样缓冲液混合，加热（95°C，5分钟），在4%-12% Bis-Tris凝胶（MOPS缓冲液）中分离，通过半干转印转移至甲醇活化的PVDF膜上。膜封闭（TBST中5%脱脂牛奶，1小时），4°C用一抗孵育过夜，然后洗涤并在室温用HRP偶联二抗孵育1小时。使用以下一抗：抗-β-actin（Santa Cruz，sc-1615；1:3000）、抗-HDAC1（Santa Cruz，sc-81598；1:1000）、抗-NR2F6（ProteinTech，60117-2-Ig；1:500）、抗-NFATc1（Santa Cruz，sc-7294；1:500）、抗磷酸酪氨酸（Cell Signaling，96215；1:500）和抗-TCF-1（Santa Cruz，sc-101170；1:1000）。

凝胶迁移率变动分析（EMSA）按前述方法进行，使用AP-1（5′-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3′）、NF-κB（5′-CTGGGGACTTTCCGCT-3′）和TCF/LEF（TOP：5′-TGTTAAGATCAAAGGGTTTAAGATC-3′；FOP：5′-TGTTAAGAAAAAAGGGTTTAAGATC-3′；对应TOP/FOP Flash报告基因序列）的共识寡核苷酸。所有寡核苷酸由Eurofins MWG Operon定制合成。简言之，探针使用T4多核苷酸激酶以γ-[32P]ATP进行32P末端标记，在G-25柱上纯化后，在结合缓冲液（40 mM Tris，200 mM NaCl，4 mM EDTA，20%甘油，4 mM DTT，0.4% BSA，含无菌水中的poly(I:C) 170 μg/mL）中加稳定剂D（Activ Motif，37488）与核提取物在4°C孵育20分钟。DNA-蛋白复合物在0.5× TBE中于5%非变性聚丙烯酰胺凝胶上以300 V电泳分离，凝胶干燥后通过放射自显影检测信号。

调整凝胶图像的亮度和对比度以提高条带可见度。任何调整在所有比较的条件之间一致应用（例如，在每个供体内部）。相应的连续图像区域在图中用黑色边框标出。

Bio-Plex技术

使用Luminex xMAP技术在Bio-Plex 200设备（BioRad）上，通过组合相应的试剂盒（Biorad；171-B5003M和171-B5019M以及ThermoFisher，EPX01A-12027–901，分别用于IL-2、IFN-γ或GZMB）按厂家说明测定细胞培养上清液中IL-2、IFN-γ和GZMB的浓度。

定量与统计分析

统计分析在GraphPad Prism（v10.2.3）或R（v4.3.3）中进行，样本量在相应的图注中注明。

正态分布的数据根据具体情况采用配对或非配对t检验进行分析，或使用单因素或双因素方差分析（存在缺失值时采用混合效应模型），随后进行Holm–?idák事后校正；p < 0.05被视为具有统计学显著性，除非另有说明，数据以均值±标准误（SEM）呈现（对于独立的生物学重复，例如供体，还会额外显示单点并用线条连接）。图中使用的星号表示统计学显著性如下：n.s. = 无显著性，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。需要注意的是，在将对照样品与使用sgRNA2或sgRNA3生成的NR2F6敲除样品进行比较时，未进行多重检验校正，因为两种sgRNA观察到的一致效应被认为在生物学上是稳健的，足以降低假阳性的风险。此外，多重检验的数学校正仅在单个标记物组间进行，而非在同一基因型内跨多个标记物进行，这反映了主要关注点在于标记物内的组间差异。补充信息（1）PDF（1.25 MB）文件S1. 图S1–S7