红圣罗勒（Ocimum tenuiflorum）对体外瘤胃发酵特性、养分消化率、甲烷产量及微生物群落组成的影响

《Animal Feed Science and Technology》：Effects of red holy basil ( Ocimum tenuiflorum) on in vitro ruminal fermentation characteristics, nutrient digestibility, methane production, and microbial community composition

　　

红圣罗勒粉以日粮干物质2%的比例添加，使体外甲烷产量降低了29.26%。红圣罗勒将瘤胃发酵转向产生更多丙酸盐。甲烷的减少并未损害营养物质的降解性。

引言

反刍动物肠道发酵过程中释放的甲烷（CH?）是农业温室气体排放的重要贡献者，也是向气候中性畜牧生产系统转型的主要障碍（Forster等，2023）。目前估计表明，畜牧业约占全球人为温室气体排放的15%，其中反刍动物贡献了其中一半以上（FAO，2023）。鉴于CH?的高全球增温潜势，减少肠道CH?排放已成为提高反刍动物生产系统环境可持续性的重要策略（IPCC，2023）。在过去十年中，已探索了多种方法来减轻反刍动物的肠道CH?排放（Hristov，2024）。这些减轻策略通常集中在直接抑制产甲烷微生物或将代谢氢（H?）引向与产甲烷作用竞争的替代瘤胃途径（Wang等，2023）。尽管各种合成饲料添加剂已证明能够降低CH?产量，但其实际应用仍受到动物安全性顾虑及其抗产甲烷效果持续时间有限的限制（Moss等，2000）。因此，植物来源的饲料添加剂作为调节瘤胃发酵和微生物活性的天然替代方案，引起了越来越多的关注（Patra和Saxena，2010；Abd El Tawab等，2024）。据报告，广泛的植物次生代谢物，包括精油、皂苷和单宁，通过其对瘤胃微生物种群和发酵过程的调节作用，能够减少肠道CH?排放（Patra和Saxena，2010；Zhou等，2020；Huang等，2026）。然而，它们的CH?减轻活性通常是间接的，主要来自原生动物的丰度和发酵途径的改变，而非直接抑制产甲烷活性。因此，它们作为产甲烷特异性抑制剂的有效性仍然相对有限。

迷迭香酸是一种天然存在的酚类化合物，在多个科的160多种植物中被鉴定出来，尤其是唇形科，代表性来源包括迷迭香、香蜂草、紫苏和罗勒属植物（Guan等，2022）。最近，迷迭香酸作为一种具有潜在抗产甲烷活性的前景植物化学物质而受到关注（Liu等，2024）。分子对接和分子动力学分析表明，迷迭香酸可以通过其狭窄的底物通道进入甲基辅酶M还原酶（MCR）的催化口袋，并与活性位点内的氨基酸残基建立氢键相互作用。这些发现表明，迷迭香酸可能与MCR的活性位点相互作用，从而有助于降低产甲烷活性（Dinakarkumar等，2021；Liu等，2024）。作为古菌CH?生物合成的关键酶，MCR催化产甲烷的终端反应，即甲基辅酶M在辅酶B的存在下被还原生成CH?。因此，抑制MCR被认为是一种抑制瘤胃中CH?形成的有前景的策略（Duin等，2016）。因此，迷迭香酸可能通过与产甲烷途径（包括MCR）的潜在相互作用来促进CH?的减轻；然而，这些提出的分子相互作用的直接实验验证仍然必要。Liu等（2024）报道，迷迭香酸的补充在体外瘤胃发酵期间将CH?产量降低了最多15%，为其CH?减轻潜力提供了实验证据。

在富含迷迭香酸的植物中，红圣罗勒（RHB）（*Ocimum tenuiflorum*），在泰国通常称为"Kaprao Daeng"，作为一种候选植物性饲料添加剂特别值得关注，因为它在亚洲热带地区广泛种植；含有多种生物活性化合物，包括迷迭香酸和其他酚类成分；并且在反刍动物营养中相对缺乏研究。RHB是一种属于唇形科的芳香草本植物，被广泛用作烹饪食材、药用植物和生物活性化合物的来源（Reddy等，2021）。先前的研究表明，RHB含有各种具有抗氧化和抗菌活性的植物化学物质（Singh和Chaudhuri，2018）。尽管具有这些特征，关于RHB补充对瘤胃CH?产量、微生物群落结构和微生物功能潜力影响的信息仍然有限。这种区域可获得性、植物化学特征和现有知识空白的结合，为评估RHB作为CH?减轻的植物性饲料添加剂提供了实用和科学的理由。因此，本研究的目的是调查RHB补充对体外瘤胃发酵、营养物质降解性、CH?产量和瘤胃微生物群落的影响。此外，还评估了预测的微生物功能谱，以探索与产甲烷和丙酸盐生物合成相关的代谢途径的潜在变化。我们假设，RHB补充将减少CH?产量，并改变瘤胃微生物群，使其与减少产甲烷和增强丙酸盐形成一致，同时不对瘤胃发酵产生不利影响。

动物伦理

本研究中使用的动物程序已获机构动物护理和使用委员会批准（农业动物；批准号AG01001/2568）。所有供体动物均饲养和管理于泰国清迈大学农学院动物与水产科学系。所有实验程序均按照相关伦理法规和实施报告指南进行。

红圣罗勒制备

新鲜的红圣罗勒（*O. tenuiflorum*）在强制通风烘箱中以60°C干燥48小时，然后使用Retsch SM100磨粉机（德国）研磨。研磨材料通过2毫米筛获得均匀粉末，并在室温下密封容器中储存以备进一步分析。

日粮配制、实验处理和化学表征

将研磨后的RHB粉末用作体外瘤胃发酵实验的测试材料。使用粗饲料与精料比例为60:40的完全混合日粮配制了四个日粮处理，并分别以底物干物质（DM）的0.0%（T1）、0.5%（T2）、1.0%（T3）或2.0%（T4）的比例添加RHB。选择0.5%、1.0%和2.0%的底物DM添加水平，是基于之前评估圣罗勒和其他植物来源植物性饲料添加剂的体外研究。

瘤胃接种物制备和孵育程序

体外发酵实验在三个独立孵育批次中进行，每批在不同天使用新鲜收集的瘤胃接种物。这些批次被视为所有测量变量的生物学重复，包括发酵特征、CH?产量、营养物质降解性和微生物群落组成。相同的三头初产泌乳奶牛，平均体重420±20.0公斤，作为所有三个孵育批次的瘤胃液供体。

发酵终产物、CH?测量和营养物质降解性

孵育24小时后，从每个处理在每批次孵育中的三个技术重复发酵瓶中采集顶空气体样品进行CH?测定。CH?浓度通过气相色谱法分析，方法如Hnokaew等（2025）先前所述，使用配备热导检测器的CheckMate 9900系统（PBI Dansensor，丹麦）。气体采样后，从相同的技术重复瓶中收集发酵液进行……

DNA提取和16S rRNA基因扩增子测序

用于微生物组表征的样品在孵育后立即采集，并储存在-80°C直至DNA提取。使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen，Hilden，德国）按照制造商的方案提取总微生物基因组DNA。DNA完整性通过2%琼脂糖凝胶电泳验证，核酸浓度使用NanoDrop 2000C分光光度计（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）定量。提取后……

qPCR定量总古菌和mcrA

使用从瘤胃发酵样品中提取的基因组DNA进行qPCR，以确定总古菌和产甲烷相关基因mcrA的相对丰度。总细菌16S rRNA基因使用正向引物5′-CGGCAACGAGCGCAACCC-3′和反向引物5′-CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC-3′（Denman和McSweeney，2006）进行定量，并作为归一化的参考。总古菌16S rRNA基因使用正向引物5′-GYGCAGCAGGCGCGAAA-3′和……

生物信息学分析

原始双端测序读段首先根据其条形码指数进行拆分。使用FastQC（v0.12.1）评估序列质量，随后使用Cutadapt（v4.5）去除条形码序列和接头污染物。序列数据使用QIIME2（v2023.9）处理，去噪、质量控制和双端读段合并使用DADA2流程进行以推断扩增子序列变异（Callahan等，2016）。随后使用……分配分类学身份。

统计分析

使用Shapiro-Wilk正态性检验和Levene方差齐性检验评估数据是否适合参数分析。发酵特征、CH?产量、气体产生动力学、营养物质降解性和qPCR数据（ΔCt值）使用线性混合模型进行分析，使用R（版本4.5.1）（R Core Team，2025）中lme4包（Bates等，2015）实现。处理作为固定效应纳入，孵育批次作为……

日粮的营养组成和植物化学特征

基础TMR和RHB的化学组成见表1。基础TMR和RHB中的CP浓度分别为17.92%和15.73%。植物化学谱分析显示，RHB的总酚含量为49.40 mg GAE/g DM，检测到的生物活性化合物列于表1。在已鉴定的植物营养素中，迷迭香酸是主要化合物（4,190.97 μg/g DM），其次是儿茶素（2,598.36 μg/g DM）和没食子酸（988.88 μg/g DM）。RHB……

气体产生动力学和累积气体产量

孵育期间的气体产生概况如补充图S1所示，相应的动力学参数见表2。各处理间在可溶性分数（a）、不可溶性分数（b）、气体产生分数速率（c）、潜在气体产量（|a|+b）或96小时累积气体产量方面均未检测到差异（p > 0.05）。

体外降解性、瘤胃pH和NH?-N浓度

RHB补充对瘤胃pH、NH?-N浓度和营养物质降解性的影响见表2。与对照处理相比，RHB补充对瘤胃pH、NH?-N浓度、IVDMD或IVOMD无显著影响（p > 0.05）。

挥发性脂肪酸谱和CH?产量

RHB补充对VFA产生的影响如图1所示。总VFA浓度不受处理影响（p > 0.05）（图1A）。同样，乙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的摩尔比例（图1B、E–H）在各处理间无差异（p > 0.05）。相比之下，补充2% RHB（T4）与T1和T2相比显著增加了丙酸的比例（图1C）（p < 0.05）。因此，乙酸与丙酸之比为……

微生物多样性和分类学组成

24小时孵育后细菌群落的alpha多样性指标如图3A和B所示。补充2% RHB（T4）与T1和T3相比显著增加了Chao1丰富度和Shannon多样性（q < 0.05）。这些结果表明，最高水平的RHB添加增加了细菌丰富度和多样性，与T1和T3相比。

微生物群落结构的差异使用基于加权的坐标分析进一步评估，以及……

qPCR定量总古菌和mcrA

RHB补充未显著影响总古菌的相对丰度（p > 0.05）（图5A）。相比之下，mcrA基因的相对丰度在处理间存在差异（p < 0.05）（图5B），且T3和T4中的丰度低于T1。

功能谱预测

与产甲烷相关的预测功能谱如图6所示。RHB补充改变了与CH?产生途径相关的几个KEGG直系同源物和酶功能的预测丰度。与CH?产生相关的基因K00399、K00401和K00402的预测丰度在所有RHB补充处理中均显著低于对照处理（T1；q < 0.05）。同样，与支持产甲烷反应相关的基因，包括K00388……

讨论

本研究观察到的植物营养素谱和抗氧化活性表明，RHB含有多种生物活性成分，包括总酚类化合物、迷迭香酸、儿茶素、没食子酸、对香豆酸和咖啡酸。在已鉴定的化合物中，迷迭香酸是RHB中的主要植物化学物质，浓度为4,190.97 μg/g DM。该值与先前报道的以干重为基础的罗勒属植物或圣罗勒的范围相当……

结论

综合这些发现表明，RHB具有作为体外CH?减轻饲料添加剂的潜力，且不会对营养物质降解性或整体瘤胃发酵产生不利影响。补充2% RHB将CH?产量降低了29.26%，并增加了丙酸的摩尔比例。

微生物群落分析和基于PICRUSt2的功能预测表明，这些反应与瘤胃微生物群落的转变有关，包括预测的Funding sources较低的代表性。 资助来源：本项目由泰国国家研究委员会（NRCT）资助，合同编号：N24A680010。 生成式AI及AI辅助技术在写作过程中的声明：在准备本稿件期间，作者使用ChatGPT-5.5（OpenAI, Inc.）仅用于语法修正、语言润色和可读性改善。该工具未用于生成原创观点、分析数据、解释结果或撰写稿件的实质性部分。所有文本均由作者仔细审阅、修改并批准，作者对发表的准确性、完整性和最终内容承担全部责任。 数据可用性声明：原始16S rRNA基因测序数据可在NCBI序列读取档案馆中获取，BioProject登录号为PRJNA1472870。当前研究中生成和分析的其余数据集可从通讯作者处合理请求获取。 CRediT作者贡献声明：Patipan Hnokaew：撰写—审阅与编辑，撰写—初稿，方法论，调查研究，形式分析，数据整理，概念构思。Chaiwat Arjin：撰写—审阅与编辑，调查研究，形式分析。Paramintra Vinitchaikul：验证，方法论。Phatthanaphong Therdtatha：方法论，调查研究。Phongsakorn Chuammitri：撰写—审阅与编辑，调查研究。Raktham Mektrirat：撰写—审阅与编辑，调查研究。Jiraporn Inthasan：方法论，形式分析。 利益冲突声明：作者声明他们没有已知的可能影响本文报告工作的竞争财务利益或个人关系。 致谢：本研究由清迈大学部分支持，并由泰国国家研究委员会（NRCT）资助。Patipan Hnokaew | Chaiwat Arjin | Paramintra Vinitchaikul | Phatthanaphong Therdtatha | Phongsakorn Chuammitri | Raktham Mektrirat | Jiraporn Inthasan | Apinya Satsook | Korawan Sringarm