《Analytica Chimica Acta》：Concentric-type immunoblotting coupled with LC-MS/MS for high-sensitivity analysis of exosomes secreted by sorafenib-stimulated hepatocellular carcinoma cells
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•CIB实现高灵敏度蛋白质检测，克服WB的假阴性问题。•构建并表征了一种天然负载索拉非尼的外泌体递送系统。•SHCC-exo通过p38 MAPK通路诱导HCC细胞凋亡。引言外泌体是一类由动物和植物来源的各种细胞类型分泌的细胞外囊泡（EVs），在细胞间通讯中发挥重要作用 [1],
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CIB实现高灵敏度蛋白质检测，克服WB的假阴性问题。
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构建并表征了一种天然负载索拉非尼的外泌体递送系统。
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SHCC-exo通过p38 MAPK通路诱导HCC细胞凋亡。
引言
外泌体是一类由动物和植物来源的各种细胞类型分泌的细胞外囊泡（EVs），在细胞间通讯中发挥重要作用 [1], [2], [3]。它们天然携带多种生物分子，包括蛋白质 [4], [5]、核酸 [6] 和脂质 [7]。与合成药物载体相比，外泌体在生物相容性和低免疫原性方面具有明显优势，使其成为天然药物递送的有吸引力的平台 [8], [9], [10]。因此，精确检测外泌体的生物学功能至关重要。
作为一种有前景的策略，外泌体药物递送为外泌体研究开辟了新的视角 [11]。索拉非尼是一种多激酶小分子抑制剂，已被批准用于治疗晚期肝细胞癌（HCC）[12], [13], [14]。然而，其临床应用受到靶向特异性差、生物利用度低等问题的限制 [15], [16]。负载索拉非尼的外泌体是一种有前景且有效的HCC治疗策略。而评估外泌体包裹索拉非尼抗HCC疗效的关键步骤是检测相关信号通路中低丰度蛋白质 [17], [18]。高灵敏度石墨烯场效应晶体管生物传感器通过检测分泌的白蛋白实现无创实时原位监测类器官命运，用于药物评估，但受限于高通量能力 [19]。电化学技术包括电化学免疫传感 [20] 和循环伏安法 [21]，然而它们存在基质干扰和非特异性吸附等固有缺陷 [22], [23]。常见的免疫测定主要包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[24], [25] 和蛋白质印迹（WB）[26], [27]。ELISA能够准确定量但检测范围较窄。WB被认为是蛋白质检测的金标准，在均匀电场下分离蛋白质 [28]。恒定电场强度导致蛋白质线性迁移速度，从而导致分辨率差 [29]。此外，该方法没有分析物富集能力，检测灵敏度低，容易出现假阴性结果。基于我们之前的研究，同心型免疫印迹（CIB）在圆形非均匀电场中运行，在更短的径向距离处电场强度指数增强 [30], [31]。结合凝胶分子筛效应，它实现了高分辨率蛋白质分离，改善了传统WB的低分辨率。得益于同心汇聚效应，蛋白质可以被高效富集。这一改进极大地提高了蛋白质样品的检测灵敏度和准确性，并大幅消除了WB测定中常见的假阴性结果。
在本研究中，分别通过超速离心分离了HCC细胞分泌的外泌体（HCC-exo）和索拉非尼刺激的HCC细胞分泌的外泌体（SHCC-exo）。这些囊泡通过透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）进行了表征。利用同心型免疫印迹（CIB）技术，实现了对外泌体中蛋白质的高灵敏度检测，以克服传统蛋白质印迹灵敏度不足的问题。通过液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）定量了外泌体中索拉非尼的载药量 [32]。此外，利用CIB技术实现了对关键信号蛋白的高灵敏度检测，从而探索了SHCC-exo的抗HCC机制。这项工作为使用外泌体作为索拉非尼的天然载体建立了框架，并引入CIB作为外泌体药物研究中低丰度蛋白质检测的灵敏分析工具。
章节片段
实验部分
材料和试剂。 10×TBST缓冲液、30% Acr/Bis（29:1）溶液、5×十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）蛋白电泳缓冲液、4×SDS-PAGE分离胶缓冲液（pH = 8.8）购自北京酷来博科技有限公司，4×Tris-HCl-SDS浓缩胶缓冲液（pH = 6.8）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（APS）购自生工生物工程（上海）股份有限公司，10×电泳转移缓冲液购自
CIB用于高灵敏度蛋白质检测
建立了基于CIB的高灵敏度分析平台，用于通用蛋白质的定性和定量评估。CIB分离系统由中心铂丝阳极和外围环形锡箔阴极组成，在圆盘状SDS-PAGE凝胶上产生圆形非均匀梯度电场（图1A和图S1）。CIB的电场强度沿径向方向向中心呈指数增长，将分离空间划分为
结论
总之，CIB被用于表征索拉非尼刺激的HCC细胞分泌的外泌体。外泌体标记物CD9、ALIX和TSG101成功定量，并具有良好的RSD值，表明CIB是传统WB的有前景的替代方法。利用其优越的灵敏度，进一步定量了SHCC-exo处理的HCC细胞中的p38和JNK通路蛋白，并证实SHCC-exo主要通过激活p38通路诱导HCC细胞凋亡
CRediT作者贡献声明
Ting Zhang: 写作——初稿，验证，方法学，调查，正式分析，数据管理。 Xinlei Yang: 方法学，调查，正式分析。 Jing Jin: 写作——审阅与编辑，监督，资源，调查。 Donghao Li: 写作——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，资金获取，概念化。 Lu Liu: 写作——审阅与编辑，监督，资源，项目管理，调查，正式分析，
利益冲突声明
作者声明，他们不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能影响本文所报告的工作。
致谢
本工作得到了中国吉林省科技发展计划项目（编号20260101055JJ）、国家自然科学基金（编号22304150、22574142、22376177）、中国高等教育学科创新引智计划（111计划，编号D18012）的支持
Ting Zhang|Xinlei Yang|Jing Jin|Donghao Li|Lu Liu
