酵母-植物来源联合体因子在人类皮肤来源细胞中展现富集的胞外代谢组与抗氧化及抗炎潜力

《Cosmetics》：Yeast–Plant-Derived Consortia Factors Exhibit an Enriched Extracellular Metabolome with Antioxidant and Anti-Inflammatory Potential in Human Skin-Derived Cells

　　

细胞将代谢物及其他生物活性因子分泌至细胞外环境，这些物质统称为分泌组（secretome）。尽管单物种分泌组已被充分研究，但物种间共培养对分泌组组成的影响仍知之甚少。本研究探讨了植物细胞与酵母细胞共培养是否能够产生新兴的分泌产物。将Ustilago cynodontis的酵母悬浮液与源自Ocimum sanctum（Tulsi）的植物细胞共培养，产生了一组新型分泌因子，称为联合体因子（Consortia Factors，CFx）。对Ustilago-Tulsi CFx（命名为CFx-α1）进行的代谢组学分析显示，其代谢组与任一单培养的代谢组相比均具有独特性且更为富集。统计聚类表明其与单培养分泌组存在差异，其中约三分之一富集的代谢物在任一单独培养的微生物中均不存在。利用一种旨在识别已验证抗氧化和抗炎代谢物的算法，研究人员发现CFx-α1显著富集了这些代谢物，包括维生素C。与该特征一致，与任一单培养条件培养基相比，CFx-α1在人类皮肤来源细胞中表现出更高的细胞内抗氧化活性，并能更有效地减弱脂多糖（LPS）诱导的NF-κB核定位。CFx-α1在1%–5%浓度范围内还能维持人真皮成纤维细胞活力。这些发现表明，植物-酵母共培养能够产生独特且功能富集的细胞外代谢组，具有抗氧化和抗炎潜力，凸显了基于联合体的培养系统作为生产用于化妆品应用的生物活性代谢物的一种有前景的策略。

植物-酵母共培养分泌组CFx-α1的代谢组特征及其抗氧化与抗炎活性

一、研究背景与目的

分泌组（secretome）是细胞分泌至细胞外空间的全部生化因子，其中低分子量代谢物如糖类、氨基酸、脂质、核苷酸、有机酸、维生素、激素、黄酮、酚类和硫代葡萄糖苷等，在生物过程中发挥重要作用。植物细胞悬浮培养和微生物发酵已被用于生产高价值次级代谢物，植物提取物、植物细胞培养产品和微生物发酵物也越来越多地用于化妆品配方。然而，单一物种分泌组虽已被广泛研究，物种间共培养对分泌组组成的影响仍缺乏系统认识。已有研究显示，内生真菌与植物共生可产生多种生物活性化合物，微藻-酵母共培养可提升生物燃料生产效率。基于此，研究人员假设植物与酵母共培养可能产生新兴的分泌产物，并构建了Ustilago cynodontis（黑粉菌，属Ustilaginaceae科）与Ocimum sanctum（圣罗勒，又称Tulsi）细胞共培养体系，以探究共培养来源的胞外代谢组是否具有独特的组成和功能活性。

二、研究内容与主要结论

研究人员将U. cynodontis酵母悬浮液与Tulsi细胞共培养7天，收集条件培养基（conditioned media）进行非靶向代谢组学（untargeted metabolomics）分析，并将共培养分泌组命名为Consortia Factors（CFx），即CFx-α1。结果显示，CFx-α1的代谢组与任一单培养分泌组显著不同，且代谢物更为富集；约三分之一的富集代谢物在两种单培养中均未检测到，提示共培养产生了新的代谢产物。通过基于文献的自动注释算法，研究人员发现CFx-α1显著富集了具有抗氧化和抗炎活性的代谢物，包括维生素C。功能实验表明，CFx-α1在人类皮肤来源细胞中表现出更强的细胞内抗氧化活性，并能有效减弱脂多糖（LPS）诱导的NF-κB（核因子κB）核定位，同时在不同浓度下维持人真皮成纤维细胞活性。这些发现表明，植物-酵母共培养是一种有前景的生物技术平台，可用于生产具有化妆品应用潜力的生物活性代谢物。

三、关键技术与方法

样本来源：Tulsi茎干细胞培养物由O. sanctum植物建立；U. cynodontis分离自当地狗牙根（Cynodon dactylon）植物，经ITS和全基因组测序确认。培养使用MS基础培养基，分别接种Tulsi（5 g愈伤组织）、Ustilago（4×10⁷细胞）及二者共培养，7天后离心收集条件培养基。代谢组学采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）反相色谱正负离子模式，数据经MS-DIAL处理，使用MetaboAnalyst进行PCA和聚类分析。代谢物功能注释采用基于PubMed文献检索和GPT-4.1 mini辅助的算法，以已发表证据鉴定抗氧化和抗炎代谢物。功能验证包括DPPH自由基清除实验、DCFDA荧光检测细胞内活性氧（ROS）、LPS诱导NF-κB核定位免疫荧光实验及MTS细胞活性实验。统计方法包括t检验、Fisher确切检验和超几何检验。

四、研究结果

4.1 共培养体系的构建与Ustilago基因组测序

研究人员从狗牙根分离真菌，经ITS测序和全基因组系统发育分析，确认该菌株为U. cynodontis。基因组比较发现，相对于参考基因组，该菌株的遗传变异在重复序列区域富集（约23个/10 kb），而基因编码区变异频率较低（约3个/10 kb）。这表明该菌株基因组具有分区进化特征。

4.2 CFx-α1独特的代谢组

通过LC-MS对三种培养物的条件培养基进行非靶向代谢组学分析，结合主成分分析（PCA）和聚类分析。结果显示，共培养（UT）样品的代谢组形成独立簇，与任一单培养分离，且不同于单培养的简单加和（U+T），表明共培养产生了独特的胞外代谢组。

4.3 CFx-α1富集的代谢组

差异分析显示，CFx-α1相对于Tulsi和Ustilago分别有429和163个上调差异代谢物（DRMs），而下调仅为98和80个。上调的平均log2倍数变化（7.1和5.3）显著高于下调的绝对值（-3.4和-1.7）。两个上调集共享89个代谢物，超几何检验显示重叠显著（p = 3.891 × 10^-13），说明富集是非随机的。

4.4 CFx-α1中有益代谢物的协同上调

对89个相互上调代谢物进行分类，发现45%存在于两种单培养中，26%仅存在于一种单培养中，29%在两种单培养中均不存在，提示共培养诱导了从头合成。85%的相互上调代谢物在CFx-α1中的丰度较单培养之和高至少4倍，表明存在协同上调作用。代表性代谢物包括维生素C、polygodial和没食子酸辛酯（octyl gallate）。

4.5 CFx-α1富集抗氧化代谢物并具有相应活性

通过文献算法注释，共鉴定出101个抗氧化代谢物。CFx-α1含有38个抗氧化代谢物，多于单培养（各32个）。LC-MS强度显示，CFx-α1中抗氧化代谢物的总丰度显著高于单培养。DPPH自由基清除实验显示，CFx-α1的清除活性最高，显著高于两种单培养。在活细胞中，用1% CFx-α1处理人真皮成纤维细胞后，细胞内ROS水平较对照降低63%，而单培养处理未达到该效果。

4.6 CFx-α1富集抗炎代谢物并具有相应活性

共注释出112个抗炎代谢物，其中CFx-α1含有78个，高于Tulsi（62个）和Ustilago（59个）。LC-MS强度显示其抗炎代谢物总丰度更高。在LPS诱导的人微血管内皮细胞（HMEC-1）炎症模型中，仅CFx-α1显著降低NF-κB p65核定位比例约25%（t检验p < 0.05；Fisher确切检验p < 1.0 × 10^-6），而两种单培养均无显著效果。

4.7 CFx-α1在不同浓度下维持成纤维细胞代谢活性

MTS实验表明，在1%、3%和5%浓度下，CFx-α1处理的成纤维细胞代谢活性分别为对照的99%、111%和107%，与未处理对照无显著差异。相反，5%未培养的MS培养基和两种单培养条件培养基使MTS信号降至48%-77%，显著低于对照。这表明CFx-α1具有更好的生物相容性。

五、讨论与结论

讨论部分指出，CFx-α1中维生素C的LC-MS强度比Tulsi高13倍，比Ustilago高27倍，尽管在单培养中维生素C信号微弱。研究人员提出，可能的机制包括前体交叉喂养、胁迫诱导信号和植物防御途径激活。这类似于自然界中黑粉菌与宿主植物互作时产生的富含维生素C的现象（如玉米黑粉菌huitlacoche）。此外，CFx-α1中还协同富集了rosmarinate、costunolide、atractylenolide III、verminoside、esculin和octyl gallate等兼具抗氧化和抗炎活性的代谢物，这些化合物的已知作用机制与观察到的细胞活性一致。但研究人员强调，本研究并不将观察到的生物学活性归因于单一代谢物，而是将CFx-α1的效应视为多种共培养富集代谢物的集体输出。基因组分析揭示的重复区变异富集与真菌中重复区为变异热点、编码区保守的模型一致，但与代谢物产生的关系尚待确立。生物相容性测试显示CFx-α1在5%浓度下仍能维持成纤维细胞活性，说明共培养过程改良了细胞外基质的组成。总体而言，CFx-α1的抗氧化和抗炎特性支持其作为化妆品原料的开发潜力。

研究结论部分翻译如下：植物-酵母共培养产生的联合体因子制剂CFx-α1，其胞外代谢组学特征与相应单培养条件培养基相比，在维生素C及其他具有抗氧化和抗炎特性的代谢物方面显著富集。这些代谢组差异伴随着人类皮肤来源细胞中抗氧化活性增强和LPS诱导的NF-κB核定位减弱，支持了CFx-α1的抗氧化活性和抗炎潜力。总之，这些发现将植物-酵母共培养确定为一个有前景的生物技术平台，用于生产生物活性胞外代谢物，并支持进一步将CFx-α1开发为生物技术来源的化妆品成分。