基于ScFv抗体磁珠分选汉普夏公猪精子的性别鉴定潜力

《Animal Reproduction Science》：Potential sex-sorting of Hampshire boar sperm with ScFv-antibody-coated magnetic beads

　　

一项基于单链可变区片段（scFv）的免疫磁珠平台被评估用于公猪精子的性别分选。H4:L4 scFv抗体在五个猪品种中显示出与品种相关的结合特性。X染色体富集组分中携带X染色体的精子比例高达77.0%，而Y染色体富集组分中携带Y染色体的精子比例高达78.6%。分离后，X染色体富集组分在体外保持了精子质量。

研究背景与目的

在现代畜牧生产中，后代性别的预先选择是提高繁殖效率和优化生产规划的重要策略。对于养猪业而言，性别控制有助于实现种猪群更新、遗传改良、终端生产规划以及管理性别相关的生产性状。然而，与牛相比，猪性别分选精液的商业化应用仍非常有限。这主要是由于猪人工授精的生物学和技术要求较高，通常每次授精剂量需要大量功能正常的精子。传统的荧光激活细胞分选技术虽然能够基于DNA含量差异区分X和Y染色体精子，但其高运营成本、低处理通量以及对精子活力和受精能力的潜在不利影响限制了其应用。为克服这些局限，研究人员探索了多种替代方案，其中基于抗体的精子性别分选技术因依赖于识别性别关联的精子表面表位而备受关注。重组抗体片段，特别是单链可变区片段（scFv），因其分子小、特异性高、可重复生产以及易于与固相载体如磁性微珠偶联等优点，展现出巨大潜力。此前，针对杜洛克公猪Y染色体精子质膜表位的H4:L4 scFv抗体已被开发并验证了其结合特异性。然而，该抗体在不同猪种遗传背景下的结合活性以及在商业化稀释精液中的分选性能尚不清楚。本研究旨在作为一项概念验证，评估先前开发的H4:L4 scFv免疫磁珠平台在汉普夏公猪品种上的跨品种转移性和工艺适用性，而非引入全新的精子分选方法。

研究方法

研究人员首先通过间接酶联免疫吸附试验（ELISA）和表面等离子体共振（SPR）分析，评估了H4:L4 scFv抗体对来自杜洛克、长白、大白、汉普夏和本地黑猪五个品种精子的品种相关性结合反应。随后，使用商业化稀释的汉普夏公猪精液，通过不同抗体包被浓度优化免疫磁珠分选性能。分选后，利用计算机辅助精子分析系统（CASA）、流式细胞术、成像流式细胞术以及定量聚合酶链反应（qPCR）等技术，分别对未结合的X富集组分和洗脱的Y富集组分的精子活力、生理状态、膜完整性、线粒体膜电位、活性氧水平以及X/Y精子比例进行了全面评估。实验样本来源于泰国清迈大学动物科技学院（杜洛克、长白、大白、本地黑猪）和瑞典K?ttf?retagen商业公猪站（汉普夏）。

研究结果

3.1 H4:L4 scFv抗体对不同猪种精子的品种相关性结合反应

通过剂量-反应曲线分析，所有品种均呈现典型的S型结合曲线。杜洛克精子结合最强，EC₅₀值为68,145个细胞，相对交叉反应性设为100%。大白猪表现几乎相同（EC₅₀=68,817，交叉反应性99.02%）。汉普夏也表现出相近的结合（EC₅₀=69,737，交叉反应性97.71%）。长白猪结合曲线略向右移（EC₅₀=71,708，交叉反应性95.03%）。本地黑猪结合曲线右移最明显（EC₅₀=83,798，交叉反应性81.32%）。

3.2 H4:L4 scFv对不同猪种常规精子的品种相关性结合反应

SPR分析显示，杜洛克精子结合响应最高（146.2 RU），其次为长白（126.7 RU）、大白（106.4 RU）、汉普夏（95.5 RU）和本地黑猪（62.7 RU）。稳定性响应和剩余结合百分比趋势一致，杜洛克最高（93.3%），本地黑猪最低（82.8%），表明抗体与各品种精子抗原均存在可检测的相互作用。

3.3 H4:L4 scFv抗体对公猪精子的浓度依赖性结合

ELISA结果显示，随着抗体浓度从0增至8 mg/mL，OD₄₅₀值逐渐升高，在8-16 mg/mL达到平台期。基于此，后续分选实验选用2至8 mg/mL的抗体浓度范围。

3.4 H4:L4 scFv包被磁珠对汉普夏品种精子分选的评估

抗体浓度从0增至4 mg/mL时，精子结合率从0.2%升至约50.05%，在8 mg/mL时趋于稳定（50.74%）。性别比例分析表明，在4 mg/mL抗体浓度下，上清液（X富集）组分中X染色体精子比例达76.8%，洗脱（Y富集）组分中Y染色体精子比例达76.6%。因此，后续实验选用4 mg/mL抗体浓度。

3.5 HL磁珠分选汉普夏公猪精子的质量评估

CASA分析显示，X富集组分的总活力（77.21%）和渐进活力（71.58%）与常规精液对照组（79.11%和75.60%）无显著差异，而Y富集组分则显著降低（64.20%和49.51%）。流式细胞术评估表明，X富集组分的膜完整精子比例（79.64%）与对照组（81.91%）相当，而Y富集组分显著下降至50.36%。X富集组分的高线粒体膜电位精子比例（68.87%）也与对照组（72.68%）接近，Y富集组分则降至42.65%。活性氧水平方面，X富集组分与对照组无显著差异，Y富集组分则显著升高。qPCR和成像流式细胞术共同确认了X富集组分中X染色体精子占比达77.0%，Y富集组分中Y染色体精子占比达78.6%。

总结与讨论

本研究表明，基于H4:L4 scFv抗体的免疫磁珠平台成功实现了汉普夏公猪精子的性别分选。尽管该抗体最初是针对杜洛克品种开发，但在汉普夏品种上仍表现出良好的结合活性和高效的分选性能。X富集组分在分选后保持了与常规精液相当的体外精子质量，包括活力、膜完整性、线粒体功能和氧化应激水平，显示出该技术在猪人工授精中的潜在应用价值。然而，Y富集组分精子质量显著下降，可能与抗体结合及洗脱过程对Y精子的损伤有关，这是未来需要优化的方向。研究结论认为，H4:L4 scFv免疫磁珠平台作为一种低成本、可扩展的精子性别分选替代方案，在跨品种应用中展现出可行性，为进一步推动猪性别控制技术的商业化奠定了基础。