一种经过工程改造的α-1,3-葡聚糖酶衍生探针能够灵敏地检测α-1,3-葡聚糖，并揭示其被曲霉菌释放的过程

《iScience》：An engineered α-1,3-glucanase-derived probe enables sensitive detection of α-1,3-glucan and reveals its soluble release by Aspergillus

　　亮点
• AglKA突变体能够特异性结合曲霉菌细胞壁中的α-1,3-葡聚糖
• 分裂荧光素酶测定法可在30分钟内灵敏检测α-1,3-葡聚糖
• 一种工程化的探针可以检测由曲霉菌释放的可溶性α-1,3-葡聚糖

摘要
α-1,3-葡聚糖是曲霉菌细胞壁的主要成分。然而，与β-1,3-葡聚糖和半乳甘露聚糖不同，之前认为α-1,3-葡聚糖不会以可溶形式释放。因此，其作为诊断生物标志物的潜力尚未得到充分探索。在这项研究中，我们改造了α-1,3-葡聚糖酶突变体，以开发针对α-1,3-葡聚糖的特异性结合蛋白和检测系统。从内切型α-1,3-葡聚糖酶AGN1和AglKA中获得了突变体，其中AglKA-CatD-D1090A缺乏酶活性，但仍保持对α-1,3-葡聚糖的强结合亲和力。利用这种探针，我们建立了一种分裂荧光素酶测定法，可以在不进行预纯化的情况下检测曲霉菌菌丝和分生孢子中的α-1,3-葡聚糖。由主要曲霉菌种类释放的可溶性α-1,3-葡聚糖可能是曲霉病的潜在补充生物标志物。

α-1,3-葡聚糖是曲霉菌细胞壁的主要成分。然而，与β-1,3-葡聚糖和半乳甘露聚糖不同，以前认为α-1,3-葡聚糖不会以可溶形式释放。因此，其作为诊断生物标志物的潜力尚未得到充分探索。在这项研究中，我们改造了α-1,3-葡聚糖酶突变体，以开发针对α-1,3-葡聚糖的特异性结合蛋白和检测系统。从内切型α-1,3-葡聚糖酶AGN1和AglKA中获得了突变体，其中AglKA-CatD-D1090A缺乏酶活性，但仍保持对α-1,3-葡聚糖的强结合亲和力。利用这种探针，我们建立了一种分裂荧光素酶测定法，可以在不进行预纯化的情况下检测曲霉菌菌丝和分生孢子中的α-1,3-葡聚糖。由主要曲霉菌种类释放的可溶性α-1,3-葡聚糖可能是曲霉病的潜在补充生物标志物。

引言
曲霉病是一种主要的机会性真菌感染，与念珠菌病和隐球菌病并列。接触空气中的曲霉菌孢子很常见；然而，患有基础肺疾病或免疫功能低下的患者特别容易感染曲霉病。随着人口老龄化的增加以及免疫抑制治疗和侵入性医疗程序的使用，曲霉病的临床重要性预计将增加。因此，灵敏可靠的诊断方法变得越来越重要。超过300万人患有慢性肺曲霉病（CPA），超过480万人患有过敏性支气管肺曲霉病，至少30万人患有侵袭性曲霉病（IA）。CPA的死亡率约为20%，而ICU患者的死亡率高达90%。曲霉病的临床表现往往与毛霉菌病的临床表现重叠，使得鉴别诊断具有挑战性。早期诊断和治疗对于改善患者结局和降低死亡率至关重要。然而，目前可用的诊断方法存在一些限制。针对真菌细胞壁多糖的血清抗原测定常作为早期检测真菌感染的辅助诊断工具。对于曲霉病，临床上通常使用检测β-1,3-葡聚糖和半乳甘露聚糖（GM）的测定方法。然而，这两种测定方法都可能受到影响，从而降低了特异性和结果解释的难度。已经开发了补充方法，包括基于曲霉菌PCR的测定法和基于单克隆抗体的测试，如JF5侧向流动装置和1D1基于半乳氨基葡聚糖的测定法，反映出对额外诊断工具的持续需求。不同的真菌抗原标志物在灵敏度、特异性和生物学来源上有所不同；因此，结合多个多糖抗原的解读可能提高诊断准确性。曲霉菌释放的其他多糖抗原可以为现有生物标志物提供补充信息，并保持快速抗原检测的实际优势。这些考虑促使我们探索曲霉菌来源的多糖作为潜在的诊断靶点。

曲霉菌种类的外壁含有大量的α-1,3-葡聚糖，这是一种由α-1,3-糖苷键组成的葡萄糖聚合物。类似的α-1,3-葡聚糖结构也存在于几种致病真菌的细胞壁中，包括副球孢子菌、组织胞浆菌、芽生菌和隐球菌。由于其在家真菌细胞壁中的丰富存在以及在人体中的缺失，α-1,3-葡聚糖成为潜在的真菌检测靶点。将其用作诊断靶点的一个考虑因素是α-1,3-葡聚糖并非仅存在于真菌中；例如，致龋口腔链球菌产生的胞外多糖中也含有α-1,3-葡聚糖结构。因此，结合检测多种真菌细胞壁多糖可能通过提供更辨别的信息来提高诊断特异性。以前使用的α-1,3-葡聚糖结合分子，如小鼠单克隆免疫球蛋白M（IgM）抗体MOPC 104E和来自α-1,3-葡聚糖酶（AglKA-CBM）的碳水化合物结合模块（CBM），对α-1,3-葡聚糖的检测具有重要价值。然而，据我们所知，目前还没有高灵敏度的α-1,3-葡聚糖检测方法。此外，对α-1,3-葡聚糖相关生物标志物的研究也基本未被探索。我们之前通过改造来自真菌内切β-1,6-葡聚糖酶和人类几丁质酶的蛋白质，开发了高亲和力的探针，用于灵敏检测β-1,6-葡聚糖和几丁质。因此，我们研究了这种策略是否可以应用于α-1,3-葡聚糖的检测。在这项研究中，我们改造了一种α-1,3-葡聚糖酶衍生的探针，并建立了分裂荧光素酶互补和夹心ELISA平台，用于灵敏检测α-1,3-葡聚糖，揭示了临床相关曲霉菌种类释放的可溶性α-1,3-葡聚糖结构。

结果
在基于氨基酸序列相似性分类的190多个糖苷水解酶（GH）家族中（CAZy数据库，https://www.cazy.org/），内切α-1,3-葡聚糖酶（EC 3.2.1.59）仅限于GH71和GH87两个家族。因此，我们选择了两种代表性的α-1,3-葡聚糖酶，即来自Schizosaccharomyces pombe的AGN1（GH71）和来自Bacillus circulans的AglKA（GH87），并生成了在催化残基处带有突变的重组变体。对于AGN1，对其催化残基D259和E262进行替换，分别用天冬酰胺（N）和谷氨酰胺（Q）替代，这两个残基对α-1,3-葡聚糖水解至关重要。AglKA包含一个催化结构域（CatD）和一个碳水化合物结合结构域。为了评估催化结构域是否可以作为α-1,3-葡聚糖检测探针的基础，通过用丙氨酸替换AglKA中催化必需的残基，生成了三种CatD变体（D1067A、D1090A和D1091A）。为了便于灵敏检测并最小化对探针功能的干扰，这些重组蛋白与小分子HiBiT肽标签融合。HiBiT是一种基于荧光的报告分子，可与非荧光片段LgBiT结合形成活性荧光素酶（NanoLuc）。这种方法在之前的几丁质检测测定中已被成功应用。因此，构建了带有HiBiT标签的α-1,3-葡聚糖酶变体，并在大肠杆菌中表达（图1A）。作为对照，先前报道的一种基于碳水化合物结合模块的α-1,3-葡聚糖检测探针AglKA-CBM也构建为带有HiBiT标签的融合蛋白。纯化的重组蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）中呈现为预期分子量的单一条带（图S1A和S1B）。

接下来，使用葡萄糖转移酶从蔗糖制备α-1,3-葡聚糖。通过荧光辅助碳水化合物电泳检测重组酶（AglKA和AGN1）与α-1,3-葡聚糖孵育后产生的降解产物，评估了其糖酵解活性的丧失。野生型酶能够生成可检测的寡糖，而所有变体产生的降解产物均低于检测限（图S2）。我们使用类似直接ELISA的测定法评估了每种探针的α-1,3-葡聚糖结合活性。由于其通常不溶于水，因此使用市售的来自地衣的可溶性α-1,3-/1,4-葡聚糖（isolichenan）作为ELISA的固定配体。在初步筛选中，只有AglKA-CBM表现出可检测的结合活性，而AglKA-CatD突变体和AGN1突变体几乎没有或没有结合活性（图1B）。在使用可溶性模型底物进行初步筛选后，我们使用热灭活的曲霉菌nidulans（HKAN）菌丝评估了探针对天然真菌细胞壁α-1,3-葡聚糖的结合情况。只有AglKA-CatD变体显示出依赖结合的HiBiT荧光增加，而野生型AglKA-CatD、AglKA-CBM和所有AGN1衍生的构建体均低于检测限。基于其在AglKA-CatD变体中的最高荧光信号（图1C和1D），选择AglKA-CatD-D1090A进行后续表征。为了进一步评估结合特异性，在用AglKA-CatD-D1090A进行探测之前，先用活性或热灭活的α-1,3-葡聚糖酶处理HKAN。只有活性酶显著降低了结合（图1E）。还使用类似处理的HKAN样本与AglKA-CatD-D1090A-HiBiT孵育后，通过荧光显微镜检测了探针的定位，并用Alexa Fluor 488（AF488）标记的抗His标签抗体进行了染色。

随后，使用葡萄糖转移酶从蔗糖制备α-1,3-葡聚糖。通过荧光辅助碳水化合物电泳检测重组酶（AglKA和AGN1）与α-1,3-葡聚糖孵育后生成的降解产物，评估了糖酵解活性的丧失。野生型酶能够生成可检测的寡糖，而所有变体产生的降解产物均低于检测限（图S2）。我们使用类似直接ELISA的测定法评估了每种探针的α-1,3-葡聚糖结合活性。由于α-1,3-葡聚糖通常不溶于水，因此使用商业上可获得的地衣来源的可溶性α-1,3-/1,4-葡聚糖（isolichenan）作为ELISA的固定配体。在测试的变体中，只有AglKA-CBM在初次筛选中表现出可检测的结合活性，而AglKA-CatD突变体和AGN1突变体几乎没有或没有结合活性（图1B）。反应性以信号/空白比表示，其中空白代表不含多糖样本的反应混合物。(C–E) 数据以三次技术重复实验的平均值±标准误（n = 3）呈现，对于(C)和(E)，以及以三次技术重复实验的平均值±标准差（n = 3）呈现，对于(D)。(C–E) 显示了至少两个独立实验的代表数据。这两种报告蛋白与合成的α-1,3-葡聚糖颗粒孵育30分钟，在加入NanoLuc底物后测量荧光。只有当报告蛋白和α-1,3-葡聚糖同时存在时，才能检测到荧光（图3C）。荧光信号随α-1,3-葡聚糖浓度的增加而增强（图3D）。为了评估SLCA的结构特异性，评估了其对一系列非目标多糖的反应性。在使用isolichenan（α-1,3-/α-1,4-葡聚糖）、淀粉（α-1,4-葡聚糖）、右旋糖酐（α-1,6-葡聚糖）、curdlan（β-1,3-葡聚糖）、层藻多糖（β-1,3-/β-1,6-葡聚糖）、pustulan（β-1,6-葡聚糖）、木聚糖（β-1,4-葡聚糖）、甘露聚糖、几丁质或壳聚糖时，未观察到可检测到的荧光（图3E）。因此，建立了一种基于AglKA-CatD-D1090A的快速、无需洗涤的 homogeneous SLCA，用于高特异性检测α-1,3-葡聚糖。

接下来，我们评估了基于AglKA-CatD-D1090A的SLCA是否可以直接检测未纯化的真菌细胞中的α-1,3-葡聚糖。我们观察到，对于热杀死的A. nidulans、Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus和Aspergillus terreus的菌丝，在0–1,000 μg/mL的范围内存在剂量依赖性的荧光响应（图4A）。相比之下，对于热杀死的Candida albicans（酵母形式）和Rhizopus oryzae（菌丝）未观察到可检测到的响应（数据未显示），因为这些物质中不含α-1,3-葡聚糖。

为了与传统的α-1,3-葡聚糖检测工具AglKA-CBM进行比较，制备了一种包含AglKA-CBM-SmBiT的报告蛋白，并将其与AglKA-CatD-D1090A-LgBiT配对使用。这种含有CBM的报告蛋白对HKAN的荧光信号低于仅使用AglKA-CatD-D1090A的配对，证明了AglKA-CatD-D1090A的优越检测能力（图4B）。

为了确认SLCA对α-1,3-葡聚糖的特异性检测，分析前将HKAN用活性或热失活的α-1,3-葡聚糖酶处理。我们观察到未经处理的HKAN和用活性酶处理的HKAN存在剂量依赖性的荧光响应，而用热失活的酶处理的HKAN则没有响应（图4C）。一致地，热杀死的A. fumigatus ags1/ags2/ags3三基因敲除株（AfS35-Δags；缺乏ags1、ags2和ags3）的菌丝未被检测到，而父本株（AfS35）则被检测到（图4D）。

我们接下来检查了SLCA是否与人类血清样本兼容。将α-1,3-葡聚糖加入到血清中并稀释和热处理后进行分析。血清中的荧光响应与从PBS获得的响应相当，表明血清基质没有显著干扰基于AglKA-CatD-D1090A的SLCA（图5C）。此外，我们还研究了血液采集抗凝剂对SLCA响应的影响。肝素（D）和EDTA（E）对SLCA响应没有影响。α-1,3-葡聚糖颗粒（0–5 μg/mL）在含有肝素（100 μg/mL）或EDTA（10 mM）的PBS中进行分析（图5D和5E）。

最后，为了克服SLCA在低配体浓度下的灵敏度限制，我们开发了一种基于AglKA-CatD-D1090A的夹心ELISA。对于捕获探针，生成了一种Strep-tag II（ST2）融合的AglKA-CatD-D1090A构建体（图6B），并使用SDS-PAGE确认了其生产和纯度（图S1D）。当用相同的A. nidulans培养上清液进行三次系列稀释分析时，夹心ELISA检测到的信号可达到243倍稀释度（图6C），而SLCA仅能检测到9倍稀释度（图5A）。对照介质的信号保持在背景水平，表明夹心ELISA的灵敏度显著更高。

总之，这些发现为利用SLCA作为检测细胞壁α-1,3-葡聚糖的敏感工具提供了依据。此外，我们开发了一种高灵敏度的ELISA方法，使用AglKA-CatD-D1090A作为检测探针。这种方法能够检测到培养上清液中可溶性的α-1,3-葡聚糖结构。这些结果表明，SLCA可作为检测临床重要真菌物种释放的可溶性α-1,3-葡聚糖结构的补充生物标志物。AglKA-CatD-D1090A作为一种敏感的检测平台已被建立起来，为开发基于α-1,3-葡聚糖的诊断方法提供了基础，这些方法可能补充现有的真菌诊断技术。

**研究的局限性**
我们的发现建立了概念验证；然而，也应承认几个局限性。首先，尽管我们成功检测到了主要临床相关曲霉菌种在培养上清液中释放的可溶性α-1,3-葡聚糖结构，但其诊断性能尚未在临床样本中进行评估。临床样本中可溶性α-1,3-葡聚糖的浓度目前尚不清楚，且可能因真菌负荷、感染种类、疾病阶段和抗真菌治疗而异。其次，需要进一步提高灵敏度以确保可靠地检测低水平的可溶性α-1,3-葡聚糖结构。最后，高分子量的α-1,3-葡聚糖通常是不溶的；因此，由曲霉菌释放的这种多糖（被我们的探针识别）假定与水溶性分子结合存在。然而，其详细的分子结构仍不清楚。未来的研究应集中在表征这些释放结构的分子形式、进一步提高检测灵敏度以及评估其在临床样本中的诊断性能上。

**资源可用性**
如需进一步信息和资源，请联系首席联系人Daisuke Yamanaka（[e-mail]）。

**材料可用性**
本研究中生成的所有独特/稳定试剂均可从首席联系人处获得，需签署材料转让协议。

**数据和代码可用性**
• 本文报告的所有数据将在请求时由首席联系人提供。
• 本文没有报告原始代码。
• 如需重新分析本文报告的数据，可向首席联系人请求额外的信息。

**致谢**
本工作得到了日本学术振兴会（JSPS）通过科学研究费（B类）（JSPS KAKENHI编号JP23H02720）（给D.Y.）、JSPS研究员费（JSPS KAKENHI编号JP26KJ1998）（给K.S.）以及日本科学技术省通过SPRING计划（JST SPRING，日本编号JPMJSP2134）（给K.S.）的支持。此外，还得到了AMED和Tsukuba Clinical Research & Development Organization（T-CReDO）（编号A23-12给D.Y.）以及Uehara Memorial Foundation（给D.Y.）的部分支持。作者还感谢Editage（https://www.editage.com）提供的英语语言编辑服务。

**作者贡献**
概念设计：D.Y.；方法学：K.S. 和 D.Y.；研究：K.S., M.K., K.M., 和 D.Y.；形式分析：K.S. 和 D.Y.；撰写——初稿：K.S. 和 D.Y.；撰写——审核与编辑：M.K., K.M., Y.A., 和 D.Y.；资金获取：K.S. 和 D.Y.；资源准备：K.S., M.K., K.M., Y.A., 和 D.Y.；监督：Y.A. 和 D.Y.

**利益声明**
K.S. 和 D.Y. 是与本工作相关的待审批专利的发明人。

**关于手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明**
在准备本工作的过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）进行语言编辑支持。使用该工具或服务后，作者对内容进行了必要的审核和编辑，并对出版物的内容负全责。

## 方法
### 关键资源表
| **试剂或资源** | **来源** | **标识符** |
|-----------------|-----------------|---------------|
| 抗体 | Anti-His-tag mAb-Alexa Fluor 488MBL | Cat# D291-A48; RRID: AB_10695477 |
| | Purified Mouse IgM λBioLegend | Cat# 401101 |
| 细菌和病毒菌株 | Escherichia coli DH5α | BioDynamics Laboratory Inc. | Cat# DS230 |
| | Escherichia coli SHuffle | New England Biolabs | Cat# C3029 |
| | Streptococcus mutans | NBRC 13955 | NBRC |
| | NBRC 13955 | |
| 生物样本 | Human Serum, Pooled | MP Biomedicals | Cat# 2930149 |
| | | |
| 化学品、肽和重组蛋白 | Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | Cat# A7030-100 |
| | Fluorescent Brightener 28 (CFW) | Sigma-Aldrich | Cat# F3543 |
| | Laminarin | Sigma-Aldrich | Cat# L9634 |
| | Mannan | Sigma-Aldrich | Cat# M3640 |
| | Isolichenan | ELICITY | Cat# GLU601 |
| | Dextran T10 | Pharmacia | N/ |
| | | Biotin Dextran | Invitrogen | Cat# D1956 |
| | Tween 20 | FUJIFILM Wako | Cat# 166–212 |
| | | |
| | Starch | FUJIFILM Wako | Cat# 195–039 |
| | | |
| | Curdlan | FUJIFILM Wako | Cat# 032–099 |
| | Chitin | FUJIFILM Wako | N/ |
| | | AD-glucose | FUJIFILM Wako | Cat# 049–31 |
| | Sucrose | FUJIFILM Wako | Cat# 193–09 |
| | | |
| | Heparin sodium | FUJIFILM Wako | N/ |
| | Acetic Acid | FUJIFILM Wako | Cat# 035–03 |
| | Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako | Cat# 196–02 |
| | 50.5M-EDTA Solution (pH 8.0) | Nacalai Tesque | Cat# 06894–14 |
| | Pustulan | InvivoGen | Cat# tlrl-pst |
| | Nigerose | Megazyme | Cat# O-NGR |
| | Nigerotriose | Megazyme | Cat# O-NGR |
| | Nigerotetraose | Megazyme | Cat# O-NGR |
| | Nigeropentaose | Megazyme | Cat# O-NGR |
| | Nigerohexaose | Megazyme | Cat# O-NGR |
| | Xylan | Megazyme | Cat# P-ACXYL |
| | Chitosan oligosaccharides | Tokyo Chemical Industry | Cat# C2762 |
| | Tween 80 | Tokyo Chemical Industry | Cat# T0546 |
| | Zymolyase 100 | Seikagaku Corporation | Cat# 12049 |
| | | | |
| | Potato Dextrose Broth | Becton, Dickinson and Company | Cat# 2549 |
| | Potato Dextrose Agar | Becton, Dickinson and Company | Cat# 2134 |
| | Brain Heart Infusion Broth | Shimadzu Diagnostics | Cat# 05509 |
| | RPMI 1640 medium | Gibco | Cat# C1187 |
| | | |
| | BTGtfB-His | | N/A |

## 作者贡献**
概念化：D.Y.；方法学：K.S. 和 D.Y.；研究：K.S., M.K., K.M., 和 D.Y.；形式分析：K.S. 和 D.Y.；撰写——初稿：K.S. 和 D.Y.；撰写——审核与编辑：M.K., K.M., Y.A., 和 D.Y.；资金获取：K.S. 和 D.Y.；资源准备：K.S., M.K., K.M., Y.A., 和 D.Y.；监督：Y.A. 和 D.Y.

**利益冲突声明**
K.S. 和 D.Y. 是与本工作相关的待审批专利的发明人。

## 手稿准备过程中生成式AI和AI辅助技术的声明**
在本工作的准备过程中，作者使用了ChatGPT（OpenAI）进行语言编辑支持。使用该工具或服务后，作者对内容进行了必要的审核和编辑，并对出版物的内容负全责。反应通过在90°C下加热5分钟来终止，降解产物的还原末端用8-氨基萘-1,3,6-三磺酸（Invitrogen，加州，美国）标记，并通过40% PAGE进行分离，具体方法如Wakita等人（2017年）所述。葡萄糖和尼格罗寡糖（DP2–6）被用作分子大小标记。将生物素化的α-葡聚糖（4 μL）固定在链霉亲和素传感器芯片上120秒。使用BLI系统（Pall ForteBio公司，加州，美国）收集结合数据。BLI测量在含有0.1% BSA和0.005% Tween 20的BLI缓冲液中进行，该缓冲液也用于基线平衡（30秒）和HiBiT标记探针的稀释。AglKA-CBM和AglKA-CatD变体在100 nM浓度下进行比较，而AglKA-CatD-D1090A则通过2倍系列稀释（12.5–200 nM）来测定结合速率常数（ka）、解离速率常数（kd）和平衡解离常数（KD），具体方法如Yamanaka等人（2020年）所述。

竞争性ELISA：合成的α-葡聚糖（5 μg/mL，PBS）被固定在96孔白色板上（Greiner Bio-One），并按照直接ELISA的方法进行处理。AglKA-CatD-D1090A-HiBiT（100 ng/mL）与葡萄糖、尼格罗寡糖（250 μM）或与竞争物相同的合成α-葡聚糖（500 μg/mL）预孵育30分钟。然后将混合物加入板中并孵育30分钟，随后进行HiBiT发光测量。

AglKA-CatD-D1090A的稳定性评估：使用涂有合成α-葡聚糖的板（5 μg/mL）通过直接ELISA进行稳定性评估。对于热稳定性，将AglKA-CatD-D1090A-HiBiT在PBS中稀释，然后在20°C–90°C下加热5分钟，冷却至室温后与等体积的检测缓冲液混合（最终浓度为0.5 μg/mL）。对于pH稳定性，将AglKA-CatD-D1090A-HiBiT在含有1% BSA的McIlvaine缓冲液中于指定的pH值下稀释后加入板中（最终浓度为0.5 μg/mL）。HiBiT的发光测量按照直接ELISA的方法进行。

SLCA：将含有SmBiT和LgBiT融合的糖结合探针的混合物（每种200 nM，5 μL）与样品溶液（10 μL）在96孔白色板上（Greiner Bio-One）混合，并在室温（23°C）下摇动孵育30分钟。然后加入NanoLuc底物（15 μL）在检测缓冲液中，使用GloMax发光仪（Promega）测量重新构成的NanoLuc的发光。

人血清加标实验：将合成的α-1,3-葡聚糖以5 μg/mL的浓度加入到人血清或PBS中。每个样本再用PBS稀释5倍，然后在90°C下加热10分钟，作为SLCA的测试样本。

夹心ELISA：将AglKA-CatD-D1090A-ST2或抗α-1,3-葡聚糖IgM MOPC104E（2 μg/mL，PBS）涂在96孔白色板上（Greiner Bio-One）作为捕获探针。阻断和洗涤后，加入样品溶液并孵育1小时。随后洗涤板，并加入AglKA-CatD-D1090A-HiBiT（1 μg/mL）作为检测探针孵育1小时。洗涤后，使用上述方法测量HiBiT的发光。

定量和统计分析：所有统计分析均使用GraphPad Prism 7.0（GraphPad Software，加州，美国）进行。数据以平均值±标准差（SD）或标准误（SEM）表示，具体见相应的图例。根据正态性测试的结果，显著差异使用双尾非配对Student's t检验或Welch’s t检验进行检测，并通过Bonferroni检验进行多重比较。具体使用的n值及其代表的含义（包括n代表技术重复还是独立生物学重复）在相应的图例中说明。单个实验所使用的统计测试详细信息也在相应的图例中提供。统计显著性定义为p < 0.05。显著性表示如下：?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。

补充信息（1）PDF（1.00 MB）：文件S1，包含图S1和S2及表S1。