《Water》：Characterization of Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes and Antimicrobial Resistance in Water Sources from the Upper Choluteca River Basin, Honduras
编辑推荐：
水源的粪便污染构成重大公共卫生风险，尤其是在卫生基础设施有限的地区。本研究对洪都拉斯上乔卢特卡河流域地表水和地下水来源中分离的大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）分离株进行了致泻性大肠杆菌（diarrheagenic E. coli,
水源的粪便污染构成重大公共卫生风险，尤其是在卫生基础设施有限的地区。本研究对洪都拉斯上乔卢特卡河流域地表水和地下水来源中分离的大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）分离株进行了致泻性大肠杆菌（diarrheagenic E. coli, DEC）病原型、抗生素耐药性及克隆相关性特征分析。研究人员通过聚合酶链式反应（PCR）对131株分离株进行了六种致泻病原型的九个标记基因筛查，并检测了其对七种抗菌药物的敏感性；DEC分离株通过肠杆菌基因间重复一致性PCR（enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR, ERIC-PCR）进行分型。总体而言，65.6%（86/131）的分离株至少携带一个DEC标记；产肠毒素大肠杆菌（enterotoxigenic E. coli, ETEC）占主导地位（46.6%），13.7%呈现混合病原型谱，主要为典型肠致病性大肠杆菌（typical enteropathogenic E. coli, tEPEC）/ETEC。71.0%的分离株鉴定为多重耐药，头孢噻肟（95.4%）和环丙沙星（93.1%）的非敏感性频率最高；亚胺培南非敏感性（51.9%）主要为中介水平（耐药率为8.4%）。st基因与头孢西丁、亚胺培南和头孢他啶的非敏感性显著相关。ERIC-PCR揭示广泛的克隆多样性，无优势谱系，提示存在来自多个来源的反复粪便输入。这些发现表明，该流域的水源（包括地下水）是DEC和多重耐药大肠杆菌的储库，强调需要在“One Health”框架内加强水质监测。
**论文解读：洪都拉斯上乔卢特卡河流域水源中致泻性大肠杆菌病原型、抗生素耐药性及克隆多样性分析**
**一、研究背景与目的**
水源的粪便污染是重大公共卫生风险，尤其对卫生基础设施有限的地区构成严重威胁。大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）作为水传播疾病相关的重要微生物，其显著的遗传可塑性使其能够获取外源遗传物质，促进毒力因子和抗生素耐药决定簇的摄取。致泻性大肠杆菌（diarrheagenic E. coli, DEC）是全世界腹泻病的重要原因，对中低收入国家五岁以下儿童的影响尤为严重，这些地区安全饮用水获取受限、卫生设施和流行病学监测系统往往不足。上乔卢特卡河流域位于洪都拉斯中南部的干旱走廊地带，是该国最重要的水文区域之一，为首都特古西加尔巴及约150万人口提供饮用水，同时支撑农业和畜牧业生产活动。然而，城市增长、农业活动及有限卫生基础设施加剧了水源对污染和病原微生物传播的脆弱性。此前研究已记录该流域地表水和地下水存在高水平的微生物污染。在此背景下，本研究旨在确定该流域地表水和地下水源中六种DEC病原型的分布频率，表征其对β-内酰胺类、氨基糖苷类和氟喹诺酮类药物的抗生素耐药性表型，并利用肠杆菌基因间重复一致性PCR（ERIC-PCR）评估分离株的克隆相关性，以期为该地区水质监测和公共卫生决策提供微生物学证据。
**二、研究设计与方法概述**
研究人员分析了2019年10月至2022年4月期间从上乔卢特卡河流域六个子流域（Río Chiquito、Choluteca Alta、Guacerique、Yeguare、San José和Río del Hombre）及Francisco Morazán和El Paraíso两省14个市镇采集的水样中获得的131株E. coli分离株，其中106株来源于地下水，25株来源于地表水。主要关键技术方法包括：①多重PCR和单重PCR扩增九个毒力标记基因（stx、aggR、eae、bfpA、lt、st、daaE、virF和ipaH），用于六种DEC病原型（STEC、EAEC、EPEC、ETEC、DAEC和EIEC）的分子检测和分型；②Kirby-Bauer纸片扩散法检测分离株对七种抗菌药物（阿莫西林-克拉维酸、头孢西丁、亚胺培南、头孢他啶、头孢噻肟、庆大霉素和环丙沙星）的敏感性，依据临床和实验室标准协会（CLSI）判定标准进行药物敏感性分类；③ERIC-PCR分子分型结合Dice系数和UPGMA聚类分析评估DEC分离株的克隆相关性；④对13株代表性DEC阳性分离株进行HeLa细胞黏附实验以表征其黏附表型。
**三、主要研究结果**
**3.1 分离株的一般特征。** 在131株E. coli分离株中，86株（65.6%）至少携带一个DEC标记基因，其中68株（51.9%）归类为单一病原型，18株（13.7%）呈现混合病原型谱（即携带两种或以上病原型标记）；45株（34.4%）未检出DEC标记。
**3.2 致泻病原型的分布。** ETEC是检出频率最高的单一病原型，共61株（46.6%）；当纳入混合病原型中携带ETEC标记的菌株时，ETEC相关标记的检出率升至60.3%。st基因（39.7%）和lt基因（36.6%）是ETEC最常见的标记基因，两者同时检出率为16.0%。EPEC位列第二（4.6%），其中tEPEC 5株（3.8%）、aEPEC 1株（0.8%）；仅检出1株STEC（0.8%），同时携带stx和eae。18株（13.7%）呈现混合病原型谱，最常见组合为tEPEC/ETEC（7.6%），其次为aEPEC/ETEC（3.8%）、EAEC/ETEC（1.5%）和STEC/ETEC（0.8%）。各子流域的病原型分布存在差异，Río del Hombre子流域DEC标记携带率最高（87.5%）。
**3.3 抗生素耐药性概况。** 整体非敏感性频率最高为头孢噻肟（95.4%）和环丙沙星（93.1%），其次为亚胺培南（51.9%）、阿莫西林-克拉维酸（41.2%）、庆大霉素（36.6%）、头孢他啶（35.1%）和头孢西丁（26.0%）。耐药（非中介）频率最高为头孢噻肟（71.0%）和环丙沙星（38.2%），亚胺培南耐药率仅为8.4%。多重耐药（MDR）表型（对≥3类抗菌药物中至少一种非敏感）在71.0%的分离株中检出；若仅计入耐药结果，MDR检出率为16.8%。
**3.4 耐药型。** 共鉴定出32种不同耐药型，26种对应MDR谱；最常见耐药型为CIP-CTX（21.4%）和IPM-CIP-CTX（11.5%），7.6%的分离株对所有七种测试药物均非敏感。环丙沙星和头孢噻肟联合非敏感性在93.1%的分离株中检出。
**3.5 致泻性大肠杆菌分离株的抗生素耐药性特征。** 在86株携带DEC标记的分离株中，98.8%对至少一种药物非敏感，73.3%符合MDR标准。头孢噻肟（94.2%）和环丙沙星（91.9%）非敏感性频率最高，两者联合非敏感性达91.9%。共鉴定出30种耐药型，最常见的为CIP-CTX（17.4%）和IPM-CIP-CTX（9.3%）。
**3.6 致泻病原型标记与抗生素耐药性的关联。** MDR频率在子流域间无显著差异（χ2=3.14；p=0.678），地表水与地下水MDR比例无统计学差异，DEC标记携带状态与MDR亦无显著关联。经Benjamini-Hochberg多重比较校正后，st基因的存在与头孢西丁（OR=4.90；校正p=0.005）、亚胺培南（OR=3.30；校正p=0.014）和头孢他啶（OR=3.41；校正p=0.014）非敏感性显著正相关；lt基因与庆大霉素非敏感性呈显著负相关（OR=0.31；校正p=0.034）。综合毒力-耐药谱聚类分析显示高度多样性，80个独特谱分布于16个聚类，聚类主要依据耐药谱而非病原型。
**3.7 通过ERIC-PCR进行克隆相关性分析。** 对82株携带DEC标记的分离株进行ERIC-PCR分型，在60%相似性阈值下解析出81种不同基因型，Simpson多样性指数为0.9997，仅有一对ETEC分离株（ECO-9和ECO-40，来自地下水）聚类在一起（相似度75%）。未检测到优势克隆，ETEC广泛分布于系统树中，地下水与地表水分离株无分层聚集，提示该流域存在来自多个来源的反复粪便输入而非单一菌株的扩散。
**3.8 HeLa细胞黏附模式。** 对13株DEC阳性分离株的HeLa细胞黏附实验显示，所有分离株均能黏附HeLa细胞；聚集性黏附模式最为常见（53.8%），其次为串联砖样模式（23.1%）、弥散性黏附（15.4%）和混合模式（7.7%）。值得注意的是，观察到的黏附表型与分子分型并非总是一致，聚集性黏附（经典EAEC特征）见于携带ETEC和EPEC标记且不含aggR基因的分离株，弥散性黏附见于tEPEC。
**四、讨论与结论总结**
本研究的讨论部分着重强调了以下几点：该流域水源中DEC检出率高（65.6%）且以ETEC为主导（46.6%），与尼日利亚地表水研究中的ETEC优势（约45%）相吻合，但异于巴西地下水和尼日利亚井水中STEC占优的报告，提示不同地理区域环境DEC群体构成存在差异。13.7%的混合病原型检出率虽低于南非约翰内斯堡环境水源研究报道的21.8%，但两者均鉴定出EPEC/ETEC组合，表明该组合不仅限于临床分离株，亦存在于水生环境中。70%以上的MDR检出率处于全球环境水源研究报告的上限水平，究其差异部分源于中介结果是否计入非敏感性分类。亚胺培南非敏感性（51.9%）中43.5%为中介，耐药仅8.4%，与印度和中国等地区环境E. coli未检出碳青霉烯类耐药情况形成对比，但因未检测碳青霉烯酶基因，需谨慎解读。st基因与多种β-内酰胺类药物非敏感性的显著关联提示毒力与耐药决定簇可能共存的遗传背景。ERIC-PCR揭示的高度克隆多样性（81/82个独特基因型）与全球多项环境水源研究结果一致，支持反复多源粪便输入的污染模式。研究局限包括：地下水与地表水分离株数量不平衡、每样本仅选单菌落可能低估多样性、黏附实验样本量小、未进行耐药机制分子表征。总体而言，这是洪都拉斯首个整合DEC病原型表征、抗生素耐药性分析和克隆相关性评估的水源研究。高频率的DEC标记携带、ETEC的优势分布、相当比例的混合病原型、显著的MDR负担（尤其头孢噻肟和环丙沙星非敏感性）以及缺乏优势克隆的高度遗传多样性，共同证明该流域水源（包括地下水）是潜在致病性E. coli和多重耐药菌株的储库，其污染模式提示反复且多来源的粪便输入。上述发现强调从One Health视角加强区域水质监测、改善卫生设施并建立环境抗生素耐药监测体系的紧迫性，与可持续发展目标3（良好健康与福祉）和可持续发展目标6（清洁饮水和卫生设施）相呼应。未来研究应纳入全基因组表征以阐明毒力和耐药机制，进一步明确这些水生储库的流行病学作用。
