密西西比湾沿岸海水细菌群落抗生素耐药性的多层级表征：培养依赖与16S rRNA基因测序联合分析

《Water》：Antibiotic Resistance in Seawater Bacterial Communities Along the Mississippi Gulf Coast

　　

抗生素耐药细菌（antibiotic-resistant bacteria）是沿海环境中的潜在关注点，尤其是用于人类活动的海滩等区域。研究人员采用培养法与不依赖培养的16S rRNA基因方法（culture-dependent and culture-independent 16S rRNA gene approaches）相结合，对美国密西西比湾沿岸七个海滩海水中的抗生素耐药细菌群落进行表征。所有采样海滩均存在抗生素耐药细菌，其中对阿莫西林（amoxicillin）耐药者最常见，其次为对红霉素（erythromycin）耐药者。混合培养细菌群落（mixed culture bacterial communities）的组成和多样性受培养基中所用抗生素的影响大于受采样海滩的影响。培养获得的细菌群落与未培养海水中的细菌群落显著不同，且多样性显著较低，但群落16S rRNA基因测序揭示的序列类型（sequence types）多于分离法所鉴定者。共获得并鉴定59株细菌分离株（bacterial isolates），最常见的属（genera）为Pseudomonas、Vibrio和Aeromonas。超过80%的分离株表现出一定程度的多重耐药（multidrug resistance）。这些结果表明，抗生素耐药性在密西西比湾沿岸海水细菌种群中常见且广泛存在，而培养法与分子方法相结合可揭示比任一单独方法更多的抗生素耐药类群（antibiotic-resistant taxa）多样性。

研究背景方面，抗生素耐药性自20世纪40年代出现以来仍被视为紧迫的公共卫生挑战，耐药细菌的出现在威胁现代医学所依赖的抗生素有效性。耐药性虽常与临床环境相关，但自然系统亦是抗生素耐药细菌和耐药基因的重要储库，水生生态系统尤其如此。淡水系统中耐药细菌或耐药基因研究较多，而沿海海洋环境中的相关研究较为分散。沿海和河口环境连接陆地与海洋生态系统，具有生态和经济价值，且海滩用于休闲活动，可导致人类暴露。海滩环境常监测潜在病原体或指示细菌，但抗生素耐药细菌并不常规评估。密西西比湾沿岸是北墨西哥湾动态且高强度利用区域，受旅游、交通、商业和休闲渔业影响，海滩还接收城市化和河流系统输入；屏障岛和河流输入使其盐度常低于典型海水。该区域沙和海水细菌群落已有基于不依赖培养的高通量16S rRNA基因测序研究，但此类方法通常不聚焦潜在人类关注细菌，也未评估抗生素耐药性。该区域近期耐药知识仅限于粪便指示菌Escherichia coli和Enterococcus分离株研究，发现近95%的E. coli和近90%的Enterococcus分离株对两种或以上抗生素耐药；而更广泛海水细菌群落及北墨西哥湾沿岸整体的耐药知识有限。因此，研究人员开展本研究，以培养依赖方法与不依赖培养的16S rRNA基因测序相结合，表征密西西比湾沿岸海滩海水中的抗生素耐药细菌群落。研究从三个层面分析：自然未富集海水细菌群落、经多种抗生素培养基培养后的混合细菌群落、以及特定抗生素耐药分离株（包括多重耐药者）的鉴定。研究预测培养获得的抗生素耐药细菌多样性低于自然群落整体多样性；但抗生素培养基混合培养物多样性仍高于分离株所揭示者；不同抗生素培养基混合培养物组成存在基础差异，且所有培养来源群落均应与自然海水群落显著不同。研究结果表明，抗生素耐药性在密西西比湾沿岸海滩海水细菌群落中常见且广泛，培养与分子方法结合可揭示比任一单独方法更多的耐药类群多样性；多重耐药在多种类群中被提示，自然海水细菌群落可能是抗生素耐药性的潜在储库，并可能转移至人类关注细菌。其意义在于扩展了该区域指示菌之外对耐药性的认识。

关键技术方法概括（不超过250字）：样本来源于美国密西西比湾沿岸7个海滩，按MDEQ海滩监测计划编号为4、5、6、7、10、12、13，于2025年4月20日11:00—13:00自西向东同日采集冲浪区表层海水。研究人员将海水过滤保存用于自然群落高通量16S rRNA基因测序；同时进行稀释涂布培养，比较未加抗生素的Mueller–Hinton（MH）琼脂与分别添加阿莫西林、环丙沙星、红霉素、卡那霉素或四环素的MH琼脂上的菌落计数；挑取代表性菌落纯化并测试多重耐药；对混合培养群落和自然海水群落进行16S rRNA基因V4区高通量测序，对分离株进行Sanger 16S rRNA基因测序及BLAST鉴定。

研究结果如下。3.1 海水中可培养抗生素耐药细菌计数（Counts of Cultured Antibiotic-Resistant Bacteria in Seawater）：通过七海滩海水涂布培养发现，所有海滩对照MH琼脂和含阿莫西林平板均有细菌生长；含红霉素平板在5个海滩（5、7、10、12、13）有生长，含四环素平板仅海滩10有生长，含卡那霉素平板仅海滩12有生长，含环丙沙星平板均无生长。对照平板计数为6.3 × 10²—3.1 × 10³ CFU mL^?1，阿莫西林平板约低一个数量级，为5.0 × 10¹—4.7 × 10² CFU mL^?1；四环素和卡那霉素平板均为1.0 × 10¹ CFU mL^?1。不同培养基间无一致的海滩计数高低模式；海滩6阿莫西林耐药菌计数最低且其他抗生素平板无生长。对照与阿莫西林计数中度相关（R = 0.53），对照与四环素计数亦中度相关（R = 0.51，但仅一个海滩），其他相关性低至无。结论为可培养耐药菌在所有海滩存在，阿莫西林耐药最常见，未获得环丙沙星耐药培养物。

3.2 自然与培养细菌群落多样性（Diversity of Natural and Cultured Bacterial Communities）：通过16S rRNA基因扩增子序列变体（amplicon sequence variants, ASVs）和置换多元方差分析（permutational analysis of variance, PERMANOVA）发现，自然海水群落与混合培养群落显著不同（R² = 0.44，F = 3.96，p < 0.001）；海滩间群落差异显著但解释变异较少（R² = 0.20，F = 1.51，p < 0.05）。排除自然海水后，混合培养群落受培养基类型（R² = 0.28，F = 1.92，p < 0.001）和海滩（R² = 0.37，F = 1.70，p < 0.01）显著影响。方差分析（analysis of variance, ANOVA）显示自然海水物种丰富度显著高于培养群落（F = 132.4，p < 0.001；Tukey HSD p-adj < 0.001）；海水丰富度为海滩13的1031至海滩10的1662，海滩效应不显著。培养群落丰富度随培养基不同（F = 9.64，p < 0.01），对照平板显著高于阿莫西林（p-adj < 0.05）和红霉素（p-adj < 0.01）；四环素和卡那霉素平板各仅一个海滩有结果，无法统计比较；最低混合培养丰富度为四环素平板海滩10的92，但其多样性低（Inverse Simpson指数1.5）。物种丰富度与Inverse Simpson多样性高度相关（R = 0.97）；自然海水多样性高于所有培养群落（p-adj < 0.001）；排除自然海水后培养基类型显著影响多样性（F = 5.03，p < 0.05），对照显著高于红霉素（p-adj < 0.05），海滩效应不显著。结论为自然海水群落多样性远高于培养群落，抗生素培养基降低多样性并影响群落结构。

3.3 自然与培养细菌群落组成（Composition of Natural and Cultured Bacterial Communities）：通过16S rRNA基因序列分类发现，自然未培养海水中优势门或主要类群为Cyanobacteriota、Bacteroidota、Gammaproteobacteria、Alphaproteobacteria和Actinobacteriota；培养群落组成差异明显，对照、阿莫西林、红霉素或四环素MH平板混合培养物均以Gammaproteobacteria为主，唯一有生长的卡那霉素平板（海滩12）以Bacteroidota和Actinobacteriota为主。科水平培养群落类群多样性高于属水平所见但仍低于未培养海水；属水平自然海水约三分之一序列无法归类，可归类的优势属多为Cyanobium或Candidatus Actinomarina，培养群落中缺失。培养中常见属包括Pseudomonas、Stenotrophomonas、Vibrio、Serratia和Shewanella；卡那霉素培养物以Flavobacterium及多个<1%的属为主，四环素培养物以Serratia和Stenotrophomonas为主。ASV水平上，未培养海水有5个优势ASVs，均见于七海滩且各占某群落>1%，仅代表Cyanobium PCC-6307（ASVs 57、25、22）和Candidatus Actinomarina（ASVs 41、37）；这些均非培养群落优势ASVs。对照MH培养物有5个优势ASVs，其中ASV 15（Pseudoalteromonas）在所有海滩培养物中优势；ASV 32（Pseudomonas oleovorans）和ASV 3（Shewanella baltica）在海滩12、5、6、4优势，ASV 76（Rheinheimera）在海滩7、5、10优势，ASV 74（Vibrio）在海滩6、10、13优势。阿莫西林培养物中Aeromonas（ASV 2）和Pseudomonas（ASV 10）常见，ASV 4亦为Pseudomonas；ASV 4和ASV 10也见于海滩10、12的红霉素培养物；ASV 16（Pseudomonas anguilliseptica）为海滩10、12红霉素培养物优势，ASV 23（Aeromonas）为海滩5、13红霉素培养物优势；卡那霉素培养物（海滩12）以Flavobacterium、Olleya marilimosa和Paenarthrobacter优势，四环素培养物（海滩10）以ASV 1（Serratia）和ASV 17（Stenotrophomonas）优势。抗生素培养基培养物优势ASVs未在非抗生素培养基中优势，所有培养群落优势ASVs均未在自然海水中优势。结论为培养群落组成与自然海水差异显著，抗生素类型和海滩影响组成，培养偏向可培养类群。

3.4 抗生素耐药分离株鉴定与多重耐药（Identification of Antibiotic-Resistant Isolates and Multi-Drug Resistance）：通过挑取菌落、纯化、Sanger 16S rRNA基因测序及四种抗生素平板复测发现，初始转移76个耐药菌落，7个未再生长，10个扩增或测序失败，最终59株用于鉴定和耐药测试；其中41株来自阿莫西林培养物，15株来自红霉素培养物，3株来自卡那霉素培养物。59株代表23个细菌属，Pseudomonas最多（22株），其次Vibrio（5株）、Aeromonas和Ectopseudomonas（各4株）、Stenotrophomonas（3株），Flavobacterium、Shewanella和Raoultella各2株。4株对测试的四类抗生素均耐药：A7-13和E7-5分别匹配Stenotrophomonas不同种，A12-4匹配Chryseobacterium cucumeris，K12-1匹配Sphingobacterium kitahiroshimense。7株对三类抗生素耐药，其中4株匹配Pseudomonas（A4-6、A7-5、E7-1、E10-3），另为A7-2（Klebsiella variicola）、A12-11（Flavobacterium aquimarinum）和E12-5（Ectopseudomonas khazarica）。37株对两类抗生素耐药，合计48株（81%）在测试条件下表现一定程度多重耐药。结论为多重耐药在分离株中普遍，部分可对四类抗生素耐药，但种水平鉴定受限。

讨论部分总结：讨论指出淡水与海洋生态系统可成为抗生素耐药储库，而沿海环境研究较有限，北墨西哥湾尤其少。本研究通过分子与培养多层级比较表明，自然海水群落丰富度约1000—1600种，与既往报告相似，约为非抗生素对照混合培养群落的5—8倍；抗生素培养基混合培养多样性低于非抗生素平板，但丰富度下降不如自然海水与培养群落间差异大，Inverse Simpson指数下降更明显，提示抗生素存在时部分种群更占优势、均匀度降低。样本采集后18 h再培养可能造成可培养性偏差，分子法仍可检测DNA。未培养海水优势Cyanobium PCC-6307和Candidatus Actinomarina在培养群落中未大量检出；培养群落以Gammaproteobacteria及部分Bacteroidota和Actinobacteriota为主，常见Serratia、Aeromonas、Vibrio、Shewanella和Pseudomonas，培养组成在海滩间变异较大，可能与海洋细菌培养的随机性有关。混合培养群落多样性高于分离株所揭示者，如卡那霉素培养物丰富度137而仅得3株分离株且均<1%，阿莫西林海滩12培养物有12株可区分分离株而群落丰富度150。耐药菌从所有七海滩培养获得，计数约10² mL^?1，非抗生素对照约10³ CFU mL^?1；环丙沙星无生长，与某些海滩沙样研究不同；阿莫西林耐药计数最高不意外，因其广泛使用、水溶且耐药常由β-lactamases提供。81%分离株多重耐药，测试抗生素属不同类别，可能反映外排泵或多种耐药性状累积，但未进行耐药基因分子验证；Stenotrophomonas、Chryseobacterium和Sphingobacterium四药耐药，提示潜在环境多重耐药储库。研究局限为仅单日采样，限制时间代表性；既往研究表明夏季指示菌耐药计数更高且海水群落具时间格局，需更长时期研究，并可结合Enterococcus等指示菌监测。作者名Vaughn et al.、Mukherjee et al.保留于原文语境。

研究结论部分翻译：研究人员采用培养依赖与不依赖培养相结合的方法，评估了美国密西西比湾沿岸七个海滩海水细菌群落中的抗生素耐药性。正如预测，自然未培养海水细菌群落的多样性远高于混合培养所获群落，但混合培养群落的多样性显著高于以分离株形式回收的细菌数量。培养与未培养细菌群落在组成上亦不同，混合培养的组成取决于生长培养基中添加的抗生素。抗生素耐药细菌在整个沿岸普遍存在，所有海滩均获得对阿莫西林耐药的培养物，许多海滩获得对红霉素耐药的培养物。抗生素耐药细菌计数约为非抗生素对照中所见计数的十分之一，但超过80%的受试抗生素耐药分离株表现出一定程度的多重耐药，部分对四类不同抗生素耐药。研究结果扩展了该地区Enterococcus和E. coli分离株中先前发现的高水平抗生素耐药性，并表明这种耐药性存在于密西西比湾沿岸自然海水群落的多种类群中。