《Horticulturae》：Genome-Wide Identification and Expression Pattern Analysis of the Stewartia gemmata WRKY Gene Family Within an Evolutionary Framework
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WRKY是植物中主要的转录因子（transcription factor, TF）家族之一，参与多种生物学过程。然而，在山茶科（Theaceae）早期分化属紫茎属（Stewartia）中，WRKY转录因子的研究尚属空白。本研究旨在鉴定和分析具有园艺应用潜力的落
WRKY是植物中主要的转录因子（transcription factor, TF）家族之一，参与多种生物学过程。然而，在山茶科（Theaceae）早期分化属紫茎属（Stewartia）中，WRKY转录因子的研究尚属空白。本研究旨在鉴定和分析具有园艺应用潜力的落叶树种天目紫茎（Stewartia gemmata）中的WRKY成员，预测其潜在功能，并探讨其与其他山茶科物种WRKY家族的进化关系。研究共鉴定到87个天目紫茎WRKY基因（SgWRKY），将其分为三个组（group I、II和III）。group I和group II-c包含的SgWRKY基因数量最多，这一模式在所检测的其余四种山茶属（Camellia）物种中亦一致存在，为深入研究这些基因的潜在功能奠定了基础。此外，研究人员揭示了叶片和花器官中的基因表达模式，并通过qRT-PCR验证，鉴定到4个在花期多个比较组中上调表达的SgWRKY基因（SgWRKY24、SgWRKY84、SgWRKY67和SgWRKY77）。共线性和选择压力分析进一步支持所分析基因对间存在序列保守性和纯化选择。顺式作用元件预测和富集分析亦表明，这4个SgWRKY基因可能在植物发育、胁迫应答和次生代谢调控中发挥作用。综上所述，上述发现为SgWRKY基因的进一步功能基因组学研究奠定了基础，并为山茶科WRKY转录因子的进化提供了见解。
**研究背景与科学问题**
WRKY转录因子（transcription factor，TF）是植物中最大的转录因子家族之一，通过结合W-box顺式元件（TTGAC(C/T)）调控靶基因转录，参与植物发育、胁迫应答及次生代谢调控。依据WRKY结构域数量和锌指基序特征可分为group I、II、III，其中group II又可细分为II-a至II-e五个亚组。山茶科（Theaceae）包含茶（Camellia sinensis）等重要经济植物，紫茎属（Stewartia）为山茶科最早分化的类群，也是该科唯一包含现存落叶物种的属。天目紫茎（Stewartia gemmata）为分布于中国东南部的落叶树种，具有较高园艺观赏价值。茶树中WRKY功能研究已较深入，但紫茎属WRKY家族研究尚属空白，其组成和进化模式是否与山茶属一致尚不清楚。因此，对天目紫茎WRKY家族进行全基因组鉴定、解析其进化特征与表达模式具有重要意义。
**研究内容与主要结论**
研究人员基于天目紫茎高质量参考基因组，鉴定到87个WRKY基因，分为group I（16个）、group II（59个）和group III（12个），其中group I和group II-c数量最多。转录组与qRT-PCR分析筛选到4个花期上调候选基因（SgWRKY24、SgWRKY84、SgWRKY67、SgWRKY77）；共线性和选择压力分析表明其在山茶科内受纯化选择、序列保守；顺式元件和GO富集分析提示其可能参与发育、胁迫应答和次生代谢调控。该研究为SgWRKY基因功能基因组学研究奠定基础，为山茶科WRKY进化提供见解。
**关键技术方法**
研究人员利用天目紫茎参考基因组（基于PacBio SMRT HiFi和Hi-C数据组装，基因组2.87 Gb，contig N50为17.43 Mb，BUSCO完整度97.7%），通过BLAST和HMM搜索鉴定WRKY成员；以MAFFT比对、trimAl修剪和IQ-TREE构建最大似然（maximum likelihood，ML）系统发育树；利用MCScanX进行基因重复和共线性分析，DnaSP计算Ka/Ks选择压力；对采自杭州植物园的54份样品（3个花期×叶片与花器官×3个生物学重复）进行转录组测序，DESeq2筛选差异表达基因，qRT-PCR验证；以PlantCARE预测顺式作用元件，KOBAS-i进行GO富集分析。
**主要研究结果**
3.1 WRKY基因家族成员的鉴定与理化性质分析：共鉴定87个SgWRKY基因，均含WRKY结构域，不均匀分布于17条染色体（1号染色体最多11个）。蛋白长度162–758个氨基酸，多为酸性不稳定蛋白且均亲水；84个定位于细胞核。
3.2 染色体定位、共线性与选择压力分析：鉴定到57对片段重复和8对串联重复；多数基因对Ka/Ks<1，受纯化选择。
3.3 保守基序分析：WRKYGQK和锌指基序（C2H2/C2HC）高度保守；少数存在WRKYGKK等变异；8个蛋白缺失锌指。MEME鉴定10个保守基序，部分基序为特定亚组特有。
3.4 顺式作用元件与GO分析：启动子区鉴定59种顺式元件，包括光响应（MRE）、激素响应（ABRE、CGTCA-motif）、胁迫响应（LTR、ARE）和发育（CAT-box）相关元件。GO富集显示SgWRKY参与胁迫应答、激素信号及衰老等过程，SgWRKY84关联注释最广。
3.5 种间系统发育、共线性与选择压力分析：ML树支持三组划分，group I为基部支系；与四种山茶科物种的共线性WRKY基因数（72–73个）远多于拟南芥（57个）；4个候选基因Ka/Ks均<1。
3.6 表达模式分析：叶片中S1–S2有683个基因上调（含3个SgWRKY），S1–S3有1089个（含6个），SgWRKY24和84在叶片两个比较组中均上调；花器官中S2–S3有1726个上调（含17个SgWRKY），S1–S3有1266个（含5个），SgWRKY67和77在花器官两个比较组中均上调，SgWRKY84在叶片和花器官中均上调。qRT-PCR验证一致：SgWRKY24在S2表达最高，其余3个持续上调。
**讨论与结论**
讨论指出，启动子中含类黄酮合成相关顺式元件（chs-CMA1a、MBSI等），提示SgWRKY可能参与类黄酮积累调控；SgWRKY24与AtWRKY18（防御反应调控因子）、SgWRKY67与AtWRKY23（根发育及类黄酮醇合成调控因子）、SgWRKY77与AtWRKY3/4（盐和Me-JA胁迫正调控因子）的共线关系暗示功能相似性；group II-c扩张可能主要源于片段重复。研究结论认为：天目紫茎87个WRKY基因结构保守，可能参与植物发育、胁迫适应和次生代谢调控；SgWRKY24、SgWRKY84、SgWRKY67和SgWRKY77在山茶科内进化保守，与叶片和花器官发育密切相关，其功能有待实验验证。该研究为紫茎属WRKY基因功能验证及山茶科WRKY进化研究奠定基础，并为未来改良紫茎属园艺性状提供了候选基因资源。
