FDX1通过ROS/p53/ME1轴抑制急性髓系白血病的进展，并逆转对铜死亡（cuproptosis）的耐药性

《iScience》：FDX1 suppresses acute myeloid leukemia progression and reverses cuproptosis resistance via the ROS/p53/ME1 axis

　　亮点
• 血清铜水平升高和FDX1表达降低与急性髓系白血病（AML）的不良预后相关
• FDX1通过ROS/p53信号通路使AML细胞对铜死亡（cuproptosis）敏感
• p53直接抑制ME1，从而将线粒体应激与铜死亡联系起来
• ME1抑制可恢复铜死亡敏感性并增强elesclomol的疗效

摘要
铜死亡是一种依赖铜的细胞死亡机制，在癌症治疗中具有潜力，但其在中性粒细胞白血病（AML）中的调控途径仍不明确。我们发现血清铜水平升高与AML患者的不良预后相关。筛查显示，铁氧还蛋白1（FDX1）在AML中显著下调，并与不良预后相关。FDX1的缺失促进了AML细胞的增殖并增强了其对铜死亡的抵抗性。机制上，FDX1增强了线粒体损伤和ROS/p53信号通路，这转录上抑制了苹果酸酶1（ME1）。ME1破坏了线粒体NAD+/NADH的平衡，并调节了脂酰化DLAT的去脂酰化过程，从而限制了铜死亡的发生。ME1在AML中高表达并支持白血病细胞的生长，而其抑制可恢复FDX1水平低细胞的铜死亡敏感性。鉴于AML患者中血清铜水平升高以及ME1抑制能够逆转低FDX1表达引起的铜死亡抵抗性，结合使用铜离子载体和ME1抑制剂可能成为AML的一种潜在治疗策略。

图形摘要

引言
急性髓系白血病（AML）是一种高度恶性的血液系统肿瘤，具有快速进展和不良临床结局的特点。目前AML的主要治疗策略依赖于强化的化疗方案，包括阿糖胞苷和蒽环类药物，通常与去甲基化剂联合使用。尽管新型靶向疗法（如ivosidenib（IDH1抑制剂）、enasidenib（IDH2抑制剂）、gilteritinib（FLT3抑制剂）和venetoclax（BCL-2抑制剂）显示出希望，但其五年总体生存率（OS）仍然很低，复发性/难治性AML的五年OS率约为10%。大多数患者最终因疾病复发或治疗耐药性及严重副作用而死亡。因此，迫切需要开发新的有效治疗策略来改善AML的预后。
铜是一种必需的微量元素，作为多种酶的关键辅因子，在各种生物氧化还原过程中起关键作用。然而，铜的过量积累可能产生显著的毒性。新兴证据表明，铜代谢失调与AML进展之间存在复杂的关系。值得注意的是，血清铜水平升高与较差的OS和无病生存率降低密切相关，这表明其在AML中的预后意义。最新研究指出，异常的铜积累会诱导一种称为铜死亡的独特形式的细胞死亡，这种死亡机制与其他已知的细胞死亡机制（如凋亡或铁死亡）不同。越来越多的证据表明，铜死亡在多种癌症类型的肿瘤进展和治疗反应中起作用。重要的是，新兴证据开始将铜死亡直接与AML联系起来。Lewis等人最近报告称，抑制血红素生物合成可触发AML中的铜死亡，这表明线粒体依赖性的蛋白毒理应激可能是白血病细胞的一个可利用的治疗脆弱点。由于铜死亡是由线粒体蛋白毒理应激介导的，AML细胞对线粒体呼吸的依赖性可能使其对铜死亡诱导具有治疗上的脆弱性。然而，决定AML中对铜死亡敏感或抵抗的机制尚未完全了解。
AML细胞的特点是线粒体代谢和氧化还原平衡异常，ROS与白血病转化、AML细胞存活、代谢重塑和治疗反应有关。过量的ROS积累可导致线粒体损伤并激活应激反应通路，其中p53是细胞死亡、氧化还原平衡和代谢重编程的核心调节因子。最新证据进一步表明，p53可能参与铜死亡相关代谢细胞死亡的调节。作为线粒体铁氧还蛋白的FDX1已被确定为蛋白质脂酰化和铜离子载体诱导的铜死亡的关键调节因子。然而，FDX1失调是否导致AML中的铜死亡抵抗，以及ROS/p53信号通路是否参与这一过程尚不清楚。
最近，ME1被确定为AML中的一个重要代谢调节因子。高水平的ME1表达被认为预示着细胞遗传学正常的AML患者的不良预后，并通过IL-6/JAK2/STAT3通路促进白血病发生。此外，NRF2已被证明通过转录上调NPM1突变AML中的ME1来维持氧化还原平衡，NRF2的抑制与venetoclax具有协同作用。这些发现表明ME1可能在AML中作为一个重要的代谢和氧化还原调节节点。然而，ME1是否参与铜死亡敏感性的调节，以及它如何与FDX1介导的线粒体应激相关联，仍然未知。
在这项研究中，我们观察到AML患者的血清铜水平显著升高，且较高水平与较差的OS相关。在铜死亡相关基因（CRGs）中，FDX1在AML中的下调程度最显著。功能研究表明，FDX1下调促进了AML细胞的增殖和铜死亡抵抗性。相反，FDX1过表达可抑制细胞增殖并显著增强AML细胞对铜死亡的敏感性。机制上，FDX1加剧了线粒体损伤并促进了ROS的积累，从而激活p53，p53转录上抑制了ME1。ME1抑制破坏了线粒体NAD+/NADH的平衡并影响了脂酰化DLAT的去脂酰化过程，从而增强了铜死亡敏感性。ME1在AML患者中高度表达并促进AML细胞的增殖。因此，利用内源性高铜水平并靶向ME1来诱导铜死亡可能为AML治疗提供一种有前景的新方法。

结果
筛查铜死亡相关基因FDX1与AML患者的预后相关
细胞内铜水平升高可触发铜死亡，但参与肿瘤铜死亡的具体调控通路仍不完全清楚。我们首先测量了AML患者的血清铜水平，发现血清铜浓度高于正常水平（图1A）。此外，血清铜水平升高与AML患者的OS呈负相关，表明血清铜水平升高可能与AML的不良预后相关（图1B）。我们进一步分析了血清铜水平是否与AML亚型相关。如表S2所示，正常血清铜水平和高血清铜水平的患者在FAB亚型分布上没有显著差异。为了评估铜离子对AML细胞的影响，我们将它们暴露于铜和铜离子载体（elesclomol）（图1C–1G），结果表明AML细胞对铜敏感，且其反应性取决于铜的剂量。值得注意的是，当用铜死亡抑制剂（四硫钼酸盐，TTM）处理时，ES-Cu对AML细胞的影响被逆转。

图1 铜死亡相关基因FDX1的筛查与AML患者的预后相关
（A）AML患者和健康对照组（AML n = 126，正常 n = 76，生物学独立样本）之间的血清Cu浓度差异。
（B）在具有存活信息的AML患者中，55名患者被分为高血清Cu组和低血清Cu组。
（C–G）ES-Cu以剂量依赖的方式降低了AML细胞的活力，而TTM逆转了这一效应。
（H）原发性AML患者的PBMCs与健康对照组（AML n = 55，正常 n = 40，生物学独立样本）中的铜死亡相关基因的mRNA水平。
（I）XENA数据库中正常组和AML患者的FDX1 mRNA表达。
（J）代表性IHC图像显示原发性AML患者（n = 11）和正常BM（n = 10）骨髓中的FDX1蛋白表达。
（K）GEPIA数据库中AML患者FDX1表达模式对OS的影响分析。使用Kaplan-Meier方法估计生存曲线并使用双边log rank测试进行比较（B和K），使用双向方差分析（ANOVA）（C–G），使用双侧Mann-Whitney U测试（H）。ns表示不显著。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001与对照相比。
迄今为止，已报道了七个与铜死亡相关的基因（FDX1、LIPT1、LIAS、PDHB、DLD、PDHA1和DLAT）。我们通过RT-PCR检测了AML患者外周血单核细胞（PBMCs）中的CRGs mRNA表达谱，并将其与健康对照组进行了比较。其中，FDX1在AML患者中表现出最显著的差异表达（图1H和1I）。然而，FDX1表达状态与我们的临床队列中的FAB亚型分布没有显著关联（表S3）。此外，IHC染色显示AML骨髓样本中的FDX1蛋白表达低于正常对照组（图1J）。进一步地，较低的FDX1表达与AML患者的较差预后相关（图1K）。这些发现表明FDX1的低表达与AML患者的不良预后呈正相关。

FDX1抑制AML细胞的生长
为了研究FDX1在AML细胞中的功能作用，我们使用CLE/DepMap基因表达数据集分析了AML细胞系中的FDX1表达（图S2）。结果显示AML细胞系中的FDX1表达具有异质性。MOLM13和THP1表现出可检测但相对较低的FDX1表达，这与原发性AML样本中观察到的FDX1表达降低一致。我们在THP1和MOLM13细胞系中建立了FDX1敲低（FDX1-KD）和FDX1过表达（FDX1-OE）模型（图2A和2B）。CCK-8检测显示FDX1过表达显著抑制了AML细胞的活力（图2C），而FDX1的耗竭显著增强了THP1和MOLM13细胞的增殖（图2D）。接下来，细胞周期分析显示FDX1过表达的AML细胞中S期细胞比例减少，G0/G1期细胞比例增加（图2E）。相反，FDX1敲低引起了相反的效果，表现为G0/G1期比例降低，S期比例增加（图2F）。

图2 FDX1抑制AML细胞的生长
（A和B）使用RT-qPCR和western blot分析FDX1过表达和FDX1敲低AML细胞中的FDX1 mRNA水平和FDX1蛋白水平。
（C和D）使用CCK-8检测在FDX1稳定过表达（FDX1-OE）和FDX1敲低（FDX1-KD）后的THP1和MOLM13细胞中指定时间点（0 h、24 h、48 h、72 h）的细胞活力。
（E和F）通过流式细胞术测量稳定FDX1过表达THP1和MOLM13细胞的细胞周期。
（G和H）通过生物发光成像每周监测携带FDX1-OE MOLM13细胞的NSG小鼠的肿瘤生长（G）以及每组小鼠的荧光素酶信号量化（H）。
（I）NSG小鼠生存的Kaplan-Meier分析。
（J和K）3周后白血病NSG小鼠骨髓中的原始细胞百分比。通过Wright-Giemsa染色检测小鼠骨髓中的细胞。比例尺：10 μm（上），25 μm（下）。
（L和M）白血病NSG小鼠肝脏和脾脏组织的HE染色。比例尺：100 μm（上），25 μm（下）。
（N和O）3周后白血病NSG小鼠的脾脏重量（N）和血红蛋白水平（O）。数据代表三次独立实验或每组五只小鼠的平均值±标准差。使用学生t测试（A、E、F、K、N和O），使用单因素ANOVA（B），使用双向ANOVA（C、D和H），使用Kaplan-Meier方法估计生存曲线并使用双边log rank测试进行比较（I）。??p < 0.01，???p < 0.001与对照相比；ns表示不显著。
基于体外研究表明FDX1上调可抑制AML细胞增殖，我们成功建立了AML小鼠模型以进一步研究FDX1在体内的作用。通过尾静脉将表达荧光素酶的FDX1过表达MOLM13细胞注入NSG小鼠，通过生物发光成像进行纵向监测白血病植入和疾病负担（图2G和2H）。与我们的体外观察一致，携带过表达FDX1的AML细胞的小鼠表现出较低的白血病负担和更长的OS（图2I）。此外，与对照组相比，AML细胞在骨髓（图2J和2K）、肝脏（图2L）和脾脏（图2M）中的浸润减少，同时伴随脾肿大（图2N）和贫血（图2O）的缓解。总体而言，FDX1过表达抑制了AML细胞的生长并显著减少了体内的白血病负担。

FDX1过表达增强AML细胞对铜死亡的敏感性
目前尚不清楚FDX1表达（铜死亡途径中的关键基因）在调节AML中的铜死亡中的作用。由于ES-Cu抑制了AML细胞的活力，我们接下来研究了FDX1表达是否影响细胞对ES-Cu的敏感性。FDX1过表达增强了ES-Cu诱导的细胞死亡（图3A），而FDX1敲低则降低了这种效应（图3B）。此外，FDX1的表达水平升高增强了ES-Cu诱导的细胞死亡（图3C），而在FDX1敲低后的AML细胞中，ES-Cu诱导的细胞死亡相对于对照组减少（图3D）。为了进一步区分ES-Cu诱导的细胞死亡与凋亡和铁死亡，我们使用不同的细胞死亡诱导剂和抑制剂进行了基于抑制剂的对照实验。ES-Cu诱导的细胞死亡可以通过铜螯合剂TTM得到缓解，但不能通过铁死亡抑制剂Fer-1或凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和BOC-D-FMK得到缓解。这些结果表明，ES-Cu主要在AML细胞中诱导铜依赖性的铜死亡，而不是以凋亡或铁死亡为主导的细胞死亡（图S3A和S3B）。为了进一步验证铜死亡的激活，我们评估了其他与铜死亡相关的标志物。除了DLAT寡聚化增加外，经过ES-Cu处理的FDX1过表达AML细胞还显示出脂质化的DLAT水平升高，而FDX1敲低则减弱了DLAT寡聚化和脂质化DLAT的水平（图3E）。此外，用铜螯合剂TTM处理部分恢复了FDX1过表达AML细胞中的生长抑制（图S3C和S3D）。

图3 FDX1过表达增强了AML细胞对铜死亡的敏感性

图注释：

（A和B）FDX1-OE和FDX1-KD AML细胞分别用指定浓度的ES-Cu（1:1比例）处理48小时，随后通过CCK-8检测细胞存活率。
（C和D）通过流式细胞术测量稳定FDX1过表达THP1和MOLM13细胞在ES-Cu处理48小时后的细胞死亡率。
（E）在稳定FDX1过表达和FDX1敲低的THP1（ES-Cu，5 nM）以及MOLM13（ES-Cu，10 nM）细胞中，通过Western blot分析脂质化的DLAT（Lip-DLAT）和DLAT寡聚化。
（F）该方案概述了将载体对照MOLM13细胞或FDX1-OE MOLM13细胞尾静脉注射到NSG小鼠体内，随后用ES（10 mg/kg）处理的过程。
（G和H）通过生物发光成像（G）和每组所有小鼠的萤光素酶信号量化（H），每周监测携带FDX1-OE MOLM13细胞的NSG小鼠的肿瘤生长情况。
（I）对NSG小鼠的生存进行Kaplan-Meier分析。
（J和K）3周后白血病患者骨髓中原始细胞的百分比。通过Wright-Giemsa染色检测小鼠骨髓中的细胞。比例尺：10 μm。
（L和M）3周治疗后，对白血病患者小鼠的肝脏和脾脏组织进行HE染色。比例尺：上图100 μm，下图25 μm。
（N和O）3周治疗后白血病患者小鼠的脾脏重量（N）和血红蛋白水平（O）。数据以三次独立实验或每组五只小鼠的平均值±标准差表示。在（A–D）和（H）中使用了双因素ANOVA，在（K、N和O）中使用了学生t检验，在（I）中使用了Kaplan-Meier方法估计生存曲线，并通过双侧log rank检验进行比较。??p < 0.01，***p < 0.001与对照组相比。

为了在体内验证这些观察结果，我们使用了一种用铜离子载体elesclomol处理的AML小鼠模型（图3F）。结果表明，与对照组相比，elesclomol处理显著减少了携带FDX1过表达AML细胞的白血病负担（图3G和3H），并延长了生存期（图3I）。此外，elesclomol处理有效抑制了FDX1过表达AML细胞向小鼠骨髓（图3J和3K）、肝脏和脾脏（图3L和3M）的浸润，同时减轻了脾肿大（图3N），并将外周血血红蛋白水平恢复到接近生理水平（图3O）。总体而言，这些发现表明FDX1增强了AML细胞对铜死亡的敏感性，并抑制了AML的进展。

FDX1过表达破坏线粒体功能

越来越多的证据表明，线粒体功能的稳定对于肿瘤干性和肿瘤发生的进展至关重要。FDX1是一种线粒体铁硫蛋白，参与电子传递。此外，作为铜死亡的关键上游调节因子，FDX1通过催化Cu2+还原为Cu+来增强铜离子的毒性。为了确定FDX1对线粒体结构和功能的影响，我们检查了THP1和MOLM13细胞的线粒体超微结构、膜电位和细胞内ROS水平。TEM显示，FDX1过表达本身就导致部分嵴结构断裂和嵴数量减少。在ES-Cu处理后，FDX1过表达细胞中的线粒体肿胀、嵴丢失和空泡化比载体对照细胞更为明显（图4A）。定量分析证实，FDX1过表达增加了具有异常超微结构的线粒体比例，并进一步加剧了ES-Cu诱导的线粒体损伤（图4B）。与这些超微结构变化一致，JC-1染色显示FDX1过表达细胞中红色聚集体的荧光减弱，绿色单体荧光增强，表明MMP的丢失。这些变化在ES-Cu处理后更为显著（图4C和4D）。流式细胞术分析和JC-1聚集体的定量进一步证实，FDX1过表达降低了THP1和MOLM13细胞中的MMP，并增强了ES-Cu诱导的线粒体去极化（图4E和4F）。鉴于线粒体损伤可以触发ROS和细胞死亡途径的激活，我们测量了细胞内的ROS水平，发现FDX1过表达促进了AML细胞中的ROS产生。在相同的ES-Cu暴露下，FDX1过表达加剧了ROS的积累（图4G和4H）。总体而言，这些发现表明FDX1过表达破坏了线粒体稳态，降低了MMP，并增加了ROS的积累，从而使AML细胞对ES-Cu诱导的线粒体损伤更加敏感。

图4 FDX1过表达破坏线粒体功能

图注释：

（A）代表性的TEM图像显示了稳定FDX1过表达THP1和MOLM13细胞在有无ES-Cu处理48小时后的情况。比例尺：上图1 μm，下图500 nm。
（B）如（A）中的实验，量化具有异常超微结构的线粒体比例（每种条件下100个线粒体）。
（C和D）共聚焦显微镜分析FDX1过表达THP1和MOLM13细胞在有无ES-Cu处理48小时后JC-1绿色单体和红色聚集体的变化。比例尺，50 μm。
（E和F）通过JC-1染色评估线粒体膜电位，并通过流式细胞术进行量化。
（G和H）通过流式细胞术测量ROS水平。数据以三次独立实验的平均值±标准差表示。在（B、F和H）中使用了双因素ANOVA。?p < 0.05，***p < 0.01，****p < 0.001与对照组相比。

FDX1通过ROST激活p53/ME1轴

为了阐明FDX1敲低在AML中诱导的铜死亡抵抗的机制，我们对FDX1敲低的MOLM13细胞进行了全面的RNA测序分析和非靶向代谢组学分析。随后的KEGG分析显示，FDX1的缺失显著改变了与DNA损伤和p53信号通路相关的基因表达模式（图5A）。作为关键的转录因子，p53调节多种控制细胞周期进展、衰老、细胞死亡和细胞代谢的目标基因。有趣的是，基于差异代谢物的细胞过程KEGG富集分析揭示了FDX1缺乏与丙酮酸代谢之间的显著关联（图5B和5C）。与对照组相比，FDX1敲低显著增加了AML细胞中的丙酮酸水平（图5D），而FDX1过表达减少了丙酮酸的积累（图5E），这促使我们提出p53的激活调节AML细胞中的丙酮酸代谢基因。为了研究p53对丙酮酸代谢的调节，我们交叉参考了p53 ChIP-seq数据（GSM2501568）、RNA-seq DEGs和丙酮酸代谢相关基因，确定ME1是p53的潜在下游目标（图5F）。与此一致，FDX1敲低细胞中ME1的表达显著上调（图5G和5H）。在MOLM13和THP1细胞中敲低p53导致ME1的mRNA和蛋白质水平均增加（图5I和5J），从而进一步支持了我们的假设。JASPAR数据库揭示了ME1启动子区域内的潜在p53结合位点（图5K），这些位点通过染色质免疫沉淀（ChIP）得到了实验验证，ChIP-PCR测定证实了p53直接结合到ME1启动子上（图5L和5M）。结合之前的证据表明p53抑制ME1表达，这些发现支持p53通过直接启动子结合转录调节ME1表达。

图5 FDX1通过ROST激活p53/ME1轴

图注释：

（A）对FDX1敲低MOLM13细胞与对照组之间鉴定的RNA-seq DEGs（p < 0.05，倍数变化≥1.5）进行KEGG分析。
（B）描绘FDX1敲低后MOLM13细胞中差异代谢物的分层聚类热图。
（C）基于非靶向代谢组学鉴定的差异代谢物进行代谢途径的KEGG分析。
（D和E）通过丙酮酸（PA）含量试剂盒检测丙酮酸水平。
（F）Venn图显示了p53 ChIP-seq数据、FDX1敲低MOLM13细胞的RNA-seq数据以及一组丙酮酸调控基因之间的交集基因。
（G）热图显示了对照组和FDX1敲低MOLM13细胞中基因的表达水平。
（H）火山图显示了对照组和FDX1敲低MOLM13细胞中基因的表达水平。
（I和J）通过RT-qPCR和Western blot分别检测敲低p53的AML细胞中ME1和p53的mRNA和蛋白质水平。
（K）在人类ME1启动子区域中显示了p53的DNA结合位点。
（L和M）在MOLM13细胞中进行了ChIP-PCR，证实了p53对ME1启动子的占据。
（N和O）在FDX1过表达或敲低细胞中，用NAC（5 mM）或H2O2（10 μM）处理后，通过Western blot确定了p53、ME1和p-γH2AX的水平。数据以三次独立实验的平均值±标准差表示。在（B）中使用了单因素ANOVA，在（E、I和L）中使用了学生t检验。***p < 0.01和****p < 0.001与对照组相比。

线粒体代谢功能障碍会产生大量的活性氧（ROS），包括超氧阴离子（O2·?）、过氧化氢（H2O2）、羟基自由基（·OH）和单线态氧（1O2）。过多的ROS积累会引发线粒体损伤、去极化和DNA损伤，同时激活p53信号通路。因此，我们提出FDX1通过升高ROS水平来激活p53，后者通过转录抑制其目标基因ME1。结果显示FDX1过表达细胞中p53表达升高，ME1水平降低，DNA损伤标志物p-γH2AX增加。为了验证这一机制，用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）处理可以逆转这种效应，因为它消除了升高的ROS水平（图5N）。相反，FDX1敲低减少了ROS的产生，下调了p53，增加了ME1的表达，并减弱了p-γH2AX的表达。值得注意的是，H2O2的补充恢复了FDX1缺乏细胞中的p53/ME1轴激活并加剧了DNA损伤（图5O）。这些发现共同表明FDX1通过ROS生成来调控p53的激活，从而实现p53对其下游目标ME1的转录调节。

ME1通过破坏线粒体NAD+/NADH稳态来促进对铜死亡的抵抗

ME1是一种关键的细胞质代谢酶，催化苹果酸脱羧为丙酮酸。最近的研究表明，ME1在多种癌症中高度过表达，并与肿瘤增殖、转移和治疗抵抗密切相关。然而，ME1在AML中的功能意义尚未得到充分探索。与正常组相比，AML患者的ME1 mRNA和蛋白质水平较高（图6A和6B）。此外，ME1表达水平较高的AML患者生存期较差（图6C）。我们构建并验证了ME1敲低和ME1过表达的AML细胞系（图6D和6E）。ME1敲低显著降低了AML细胞的存活率（图6F）。ME1抑制剂处理同样降低了AML细胞的存活率（图6G）。相反，ME1过表达增强了AML细胞的存活率（图6H）。随后，我们分析了ME1抑制对AML细胞中ES-Cu敏感性的影响。值得注意的是，抑制ME1显著增强了ES-Cu诱导的铜死亡（图6I和6J），而ME1上调则增加了AML细胞对铜死亡的抵抗（图6K）。

图6 ME1通过破坏线粒体NAD+/NADH稳态促进对铜死亡的抵抗

图注释：

（A）比较了AML患者和健康对照组（AML：n = 55，正常：n = 40，生物学独立样本）的PBMCs中的ME1 mRNA表达。
（B）代表性的IHC图像显示了原发性AML患者和正常BM中的ME1蛋白表达。比例尺：50 μm（上），25 μm（下）。(C) 使用Kaplan-Meier Plotter数据库对AML患者中ME1表达模式的影响进行OS分析。(D和E) 通过RT-qPCR和Western blot分别检测稳定ME1敲低和ME1过表达细胞中的ME1 mRNA和蛋白质水平。(F–H) 在稳定ME1敲低（F）、50 μM ME1抑制剂处理（G）和ME1过表达（H）后，使用CCK-8检测在指定时间点（0、24、48和72小时）的细胞活力。(I–K) 在ME1敲低的THP1和MOLM13细胞中，分别用50 μM ME1抑制剂处理（J）和ME1过表达（K），然后暴露于不同浓度的ES-Cu（比例为1:1），使用CCK-8检测细胞活力。(L–N) 在ME1敲低（L）、用ME1i（50 μM）药理抑制ME1（M）或ME1过表达（N）后，检测THP1和MOLM13细胞中的线粒体NAD+/NADH比率。(O和P) 通过CCK-8检测ES-Cu诱导的细胞死亡。在ME1敲低的AML细胞（O）或用ME1i处理的AML细胞（P）暴露于ES-Cu的情况下进行了丙酮酸（PA）（1 mM）的挽救实验。(Q–S) 检测暴露于ES-Cu的THP1和MOLM13细胞中DLAT寡聚化的代表性Western blot。丙酮酸（1 mM）补充减少了由ME1敲低（Q）或ME1i处理（R）引起的DLAT寡聚化，而ME1过表达在ES-Cu处理下减少了DLAT寡聚化（S）。数据以三次独立实验的平均值±标准差表示。在(A、D、E和L–N)中使用了Student's t检验，在(F–K)中使用了双因素ANOVA，在(O和P)中使用了一因素ANOVA。??p < 0.01，???p < 0.001 vs. 对照组。最近的研究表明，ME1通过苹果酸-天冬氨酸穿梭（MAS）影响线粒体NAD+/NADH的平衡。脂质化的DLAT（lip-DLAT）的去脂质化依赖于NAD+，Cu与脂质化的DLAT结合会诱导其寡聚化，从而触发铜死亡。基于这些发现，我们假设ME1缺乏通过减少NAD+来抑制lip-DLAT的去脂质化，导致lip-DLAT的积累。我们的结果显示，ME1抑制导致线粒体NAD+/NADH水平下降（图6L和6M），同时DLAT寡聚化增加（图6Q）。类似地，ME1抑制剂处理促进了DLAT寡聚化（图6R）。为了测试NAD+/NADH不平衡是否介导了ME1抑制对铜死亡敏感性的影响，我们向细胞中补充了丙酮酸，这是一种支持NAD+再生的氧化还原活性代谢物。在ME1敲低和ME1抑制剂处理的AML细胞中，丙酮酸减少了ES-Cu处理下由ME1抑制引起的DLAT寡聚化（图6Q和6R）。一致地，丙酮酸在ES-Cu处理下恢复了细胞活力（图6O和6P）。然而，ME1过表达提高了线粒体NAD+/NADH比率（图6N），同时伴随着寡聚体DLAT水平的下降（图6S）。这些结果表明，ME1抑制破坏了线粒体NAD+/NADH的平衡，从而促进了DLAT寡聚化，并使AML细胞对铜死亡更加敏感。ME1抑制剂与铜离子载体的组合有效抑制了AML的进展。FDX1抑制显著增加了AML细胞中的ME1表达。为了确定ME1是否介导FXD1依赖的铜死亡调节，我们在具有稳定FXD1敲低的细胞中敲低了ME1（图7A和7B）。ME1敲低恢复了在ES-Cu处理下由FXD1缺乏减少的DLAT寡聚化（图7C），并逆转了FXD1缺乏引起的铜死亡抗性（图7D和7E）。这些发现表明，FXD1通过下调ME1来促进铜死亡，而ME1调节了脂质化的DLAT。图7 ME1抑制剂与铜离子载体的组合有效抑制了AML的进展。显示完整标题。图查看器(A和B) 在FXD1敲低和FXD1/ME1双重敲低的AML细胞中，通过RT-qPCR分析FXD1和ME1 mRNA水平。(C) 通过Western blot分析在FXD1敲低和FXD1/ME1双重敲低的AML细胞中，由ES-Cu（5 nM用于THP1细胞；10 nM用于MOLM13细胞）诱导的DLAT寡聚化。(D和E) 通过CCK-8检测在FXD1敲低和FXD1/ME1双重敲低的AML细胞中，由ES-Cu介导的细胞活力。(F和G) 在MOLM13移植的NSG小鼠中，每周通过生物发光成像监测肿瘤生长（F），并量化每组所有小鼠的萤光素酶信号（G）。(H) 通过Kaplan-Meier分析评估用ES、ME1抑制剂或ES和ME1抑制剂组合治疗的MOLM13移植的NSG小鼠的生存情况。(I) 在3周治疗后，白血病NSG小鼠骨髓中的原始细胞百分比。(J–L) 在3周治疗后，白血病NSG小鼠的代表性脾脏图像（J）、脾脏重量（K）和血红蛋白水平（L）。(M和O) 绘制了每个实验组在有无ES和ME1抑制剂治疗后的血清ALT、尿素和肌酐水平。数据以三次独立实验的平均值±标准差表示，每组五只小鼠。在(A、B、G、I和K–O)中使用了单因素ANOVA，在(D和E)中使用了双因素ANOVA，在(H)中使用Kaplan-Meier方法估计生存曲线，并使用双侧对数秩检验进行比较。??p < 0.01，???p < 0.001 vs. 对照组。最近的研究表明，ME1通过苹果酸-天冬氨酸穿梭（MAS）影响线粒体NAD+/NADH的平衡。脂质化的DLAT的去脂质化依赖于NAD+，Cu与脂质化的DLAT结合会诱导其寡聚化，从而触发铜死亡。基于这些发现，我们假设ME1缺乏通过减少NAD+来抑制lip-DLAT的去脂质化，导致lip-DLAT的积累。我们的结果显示，ME1抑制导致线粒体NAD+/NADH水平下降（图6L和6M），同时DLAT寡聚化增加（图6Q）。同样，ME1抑制剂处理促进了DLAT寡聚化（图6R）。为了测试NAD+/NADH不平衡是否介导了ME1抑制对铜死亡敏感性的影响，我们向细胞中补充了丙酮酸，这是一种支持NAD+再生的氧化还原活性代谢物。在ME1敲低和ME1抑制剂处理的AML细胞中，丙酮酸减少了ES-Cu处理下由ME1抑制引起的DLAT寡聚化（图6Q和6R）。一致地，丙酮酸在ES-Cu处理下恢复了细胞活力（图6O和6P）。然而，ME1过表达提高了线粒体NAD+/NADH比率（图6N），同时伴随着寡聚体DLAT水平的下降（图6S）。这些结果表明，ME1抑制破坏了线粒体NAD+/NADH的平衡，从而促进了DLAT寡聚化，并使AML细胞对铜死亡更加敏感。ME1抑制剂与铜离子载体的组合有效抑制了AML的进展。FDX1抑制显著增加了AML细胞中的ME1表达。为了确定ME1是否介导FXD1依赖的铜死亡调节，我们在具有稳定FXD1敲低的细胞中敲低了ME1（图7A和7B）。ME1敲低恢复了在ES-Cu处理下由FXD1缺乏减少的DLAT寡聚化（图7C），并逆转了FXD1缺乏引起的铜死亡抗性（图7D和7E）。这些发现表明，FXD1通过下调ME1来促进铜死亡，而ME1调节了脂质化的DLAT。图7 ME1抑制剂与铜离子载体的组合有效抑制了AML的进展。显示完整标题。图查看器(A和B) 在FXD1敲低和FXD1/ME1双重敲低的AML细胞中，通过RT-qPCR分析FXD1和ME1 mRNA水平。(C) 通过Western blot分析在FXD1敲低和FXD1/ME1双重敲低的AML细胞中，由ES-Cu（5 nM用于THP1细胞；10 nM用于MOLM13细胞）诱导的DLAT寡聚化。(D和E) 通过CCK-8检测在FXD1敲低和FXD1/ME1双重敲低的AML细胞中，由ES-Cu介导的细胞活力。(F和G) 在MOLM13移植的NSG小鼠中，每周通过生物发光成像监测肿瘤生长（F），并量化每组所有小鼠的萤光素酶信号（G）。(H) 通过Kaplan-Meier分析评估用ES、ME1抑制剂或ES和ME1抑制剂组合治疗的MOLM13移植的NSG小鼠的生存情况。(I) 在3周治疗后，白血病NSG小鼠骨髓中的原始细胞百分比。(J–L) 在3周治疗后，白血病NSG小鼠的代表性脾脏图像（J）、脾脏重量（K）和血红蛋白水平（L）。(M和O) 绘制了每个实验组在有无ES和ME1抑制剂治疗后的血清ALT、尿素和肌酐水平。数据以三次独立实验的平均值±标准差表示，每组五只小鼠。在(A、B、G、I和K–O)中使用了单因素ANOVA，在(D和E)中使用了双因素ANOVA，在(H)中使用Kaplan-Meier方法估计生存曲线，并使用双侧对数秩检验进行比较。??p < 0.01，???p < 0.001 vs. 对照组；ns，无显著性。为了评估铜死亡作为AML治疗策略的潜力，进行了一项体内研究，使用了铜离子载体和ME1抑制剂的组合。将MOLM13细胞注射到NSG小鼠的尾静脉中。ME1抑制剂单独治疗比载体治疗显著减少了白血病负担。值得注意的是，elescromol与ME1抑制剂的联合治疗进一步减少了白血病负担（图7F和7G）。此外，这种联合治疗显著延长了生存时间（图7H），减少了骨髓中的原始细胞百分比（图7I），防止了脾肿大（图7J和7K），并缓解了贫血（图7L），相比单独治疗。评估elescromol和ME1抑制剂的安全性和毒性是临床应用中的关键考虑因素。血液生化分析显示，用药后ALT、尿素和肌酐水平没有统计学上的显著差异，表明用elescromol、ME1抑制剂或其组合治疗的小鼠没有明显的肝或肾毒性（图7M和7O）。总之，这些发现表明，ME1抑制剂与elescromol的组合有效逆转了AML中的铜死亡抗性，代表了一种有前景的AML治疗策略。讨论铜平衡失调已成为肿瘤发生的关键驱动因素，癌细胞表现出增加的铜摄取以满足其代谢和增殖需求。AML患者中升高的血清铜浓度与不良临床结果显著相关，包括完整的缓解（CR）率降低和长期生存率较差，这与我们的发现一致。这些发现表明铜可能同时作为AML的预后生物标志物和治疗目标。最近的进展确定了铜死亡，一种依赖铜的线粒体细胞死亡形式，作为潜在的治疗目标。最近的研究表明，通过线粒体功能障碍和铜处理失调，抑制血红素生物合成会触发铜依赖的细胞死亡。这项研究支持了铜死亡可以在AML中作为治疗手段的概念。他们的工作主要集中在血红素生物合成作为上游代谢脆弱性，而我们的研究则是从AML患者中升高的血清铜水平的临床观察开始的，并证明AML中FXD1表达减少促进了细胞增殖和铜死亡抗性。机制上，FXD1上调通过促进线粒体损伤激活ROS/p53/ME1轴。ME1通过调节线粒体NAD+/NADH平衡来调节铜死亡敏感性。值得注意的是，ME1抑制剂和铜离子载体（如elescomol）的组合在体外和体内都协同抑制了AML的进展。FXD1是一种参与电子传输的线粒体铁硫蛋白。FXD1在肝细胞癌（HCC）组织中的表达显著降低，显示与微血管侵袭（MVI）和晚期TNM分期呈负相关，表明其潜在的肿瘤抑制功能。FXD1下调通过PI3K/AKT途径激活促进细胞凋亡和肿瘤进展。此外，FXD1缺乏在HCC细胞中诱导了脂质代谢和氨基酸代谢的双重代谢失调，从而维持肿瘤细胞增殖。在甲状腺癌中，FXD1的表达在恶性组织中显著降低，而铜离子载体通过诱导甲状腺癌细胞中的铜死亡有效抑制了恶性进展。最近在 triple-negative breast cancer（三阴性乳腺癌）中的研究表明，AKT1磷酸化FXD1以促进铜死亡抗性。FXD1在透明细胞肾细胞癌（ccRCC）中显著下调转录，这与不良临床结果相关，作为独立的预后指标。功能分析表明，FXD1过表达通过FMR1介导的途径激活抑制ccRCC的肿瘤发生和转移扩散。我们的研究确定FXD1是AML患者中最显著下调的CRG，FXD1表达降低与AML患者的较差OS相关。FXD1缺乏促进AML细胞增殖并赋予对铜死亡的抵抗力，而FXD1过表达抑制AML进展并增强对铜死亡的敏感性。FXD1过表达加剧了线粒体损伤，触发ROS积累和随后的p53激活，这些发现与先前报道的ROS和p53激活相关。p53参与多种靶基因的转录调节，这些基因参与细胞周期进展、衰老、细胞死亡和代谢调节等细胞过程。特别是，铜死亡与细胞代谢途径密切相关。在我们的研究中，p53转录抑制ME1表达，从而调节丙酮酸代谢。这些观察表明，FXD1上调通过破坏线粒体功能激活ROS/p53/ME1信号轴，从而影响AML细胞的代谢。ME1是一种细胞质中的苹果酸酶，催化苹果酸转化为丙酮酸，这些过程对肿瘤代谢和氧化还原调节至关重要。Zhang等人显示，ME1在AML中高度表达，并预测预后较差，可能通过激活IL-6/JAK2/STAT3途径。Hu等人进一步证明NRF2通过ME1在NPM1突变的AML中维持氧化还原平衡，并且NRF2抑制与venetoclax具有协同作用。与这些报告一致，我们观察到AML中ME1表达升高，并且高ME1表达与不良预后相关。ME1将糖酵解与TCA循环联系起来，通过回收苹果酸产生丙酮酸作为整个细胞代谢网络的中心介质，并充当细胞质和线粒体代谢之间的桥梁。然而，ME1在铜死亡调节中的作用之前尚未明确。ME1缺乏显著抑制AML细胞增殖并增强对铜死亡的敏感性。铜死亡是指一种线粒体细胞死亡途径，铜直接结合并促进lip-DLAT的寡聚化，而lip-DLAT的去脂质化依赖于NAD+。ME1抑制通过调节MAS循环减少了线粒体NAD+/NADH比率。与先前的研究一致，我们的结果显示，ME1缺乏和ME1抑制剂都降低了线粒体NAD+水平，伴随着lip-DLAT和寡聚体DLAT水平的增加，在ES-Cu处理下。我们的工作揭示了ME1抑制或耗尽通过破坏DLAT去脂质化增强了铜死亡敏感性，这一过程依赖于NAD+的可用性。AML患者中升高的基础铜水平为铜死亡的诱导提供了治疗窗口。然而，AML患者中FXD1的下调构成了一个重要障碍。我们结合elescomol和ME1抑制剂的策略通过同时利用AML固有的铜过载和ME1过表达克服了这一阻力。血液生化分析进一步表明，给予ES-Cu没有引起小鼠的肝或肾损伤。体外和体内实验结果都表明，针对ME1抑制和诱导铜死亡的联合疗法可能构成治疗AML患者的有效和安全的治疗策略。尽管如此，因为在从体内治疗组分离的肿瘤细胞中没有直接评估关键的机制标志物，因此对所提出的机制轴进行直接的体内验证仍然是一个重要的限制，需要在未来的研究中使用足够的动物来源材料进行进一步研究。总的来说，我们的发现表明，FXD1表达降低促进了AML细胞增殖和对铜死亡的抵抗力，而FXD1过表达通过激活ROS/p53/ME1轴增强了AML细胞对铜死亡的敏感性。ME1抑制破坏了线粒体NAD+/NADH的平衡，促进了DLAT寡聚化，并恢复了FXD1缺乏引起的铜死亡抗性。这些结果表明，利用升高的铜可用性和靶向ME1可能代表了一种潜在的AML治疗策略。研究的局限性应承认本研究的几个局限性。首先，ME1抑制在铜失调的癌症中的更广泛适用性仍有待测试。其次，在临床转化之前，还需要进一步优化铜离子载体和ME1抑制剂的药代动力学和安全性。此外，尽管血清铜、FXD1和ME1分别与AML进展和/或预后相关，但并不是所有患者都有这三个变量的完整配对数据以及生存信息。因此，我们无法可靠地评估它们之间的潜在相互作用，也无法在当前队列中构建一个三变量的预后模型。未来需要进行前瞻性的多中心研究，这些研究需要包含完整的匹配临床和分子数据，以验证铜-FDX1-ME1轴的预后价值和治疗相关性。

资源可用性
主要联系人
如需进一步信息和资源，请联系主要联系人Xiaozhong Wang（[e-mail]）。

材料可用性
本研究没有生成新的独特试剂。

数据和代码可用性
- 本研究生成的RNA测序数据已存储在NCBI基因表达组学数据库（GEO）中，公开访问号为GSE343704。
- 本研究未报告原始代码。
- 如有合理请求，可以从主要联系人处获得重新分析本研究数据的额外信息。

致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号82160405）的支持。

作者贡献
X.W.、B.H.和L.Y.设计了本研究。Y.X.、J.Z.、J.L.和F.Y.提供了并分析了患者临床样本。L.Y.、F.Z.、B.Q.、H.Z.、Y.Q.和K.D.进行了实验、数据分析，并准备了图表。L.Y.在X.W.的帮助下撰写了手稿。

利益声明
作者声明没有竞争利益。

STAR ★
方法
关键资源表

试剂或资源
来源标识符
抗体
FDX1抗体：Abmart，货号T510671
DLAT抗体：Cell Signaling Technology，货号12362
硫辛酸抗体：Abcam，货号ab58724
p53抗体：Cell Signaling Technology，货号9282
ME1抗体：Abmart，货号TD4217
γ-H2AX抗体：Abmart，货号M63324
β-actin抗体：Proteintech，货号66009-1-Ig

细菌和病毒株
FDX1敲低慢病毒载体：Genechem N/
FDX1过表达慢病毒载体：Genechem N/
ME1敲低慢病毒载体：Genechem N/
ME1过表达慢病毒载体：Genechem N/
p53敲低慢病毒载体：Genechem N/
萤光素酶表达载体：Genechem N/

生物样本
来自AML患者的 peripheral blood 和骨髓样本：南昌大学第二附属医院
来自健康对照组的 peripheral blood 和骨髓样本：南昌大学第二附属医院

化学品、肽和重组蛋白
Elesclomol (ES)：Selleck Chemicals，货号S1052
氯化铜 (CuCl2)：Sigma-Aldrich，货号751944
四硫钼酸盐 (TTM)：Sigma-Aldrich，货号323446
ME1酶抑制剂 (ME1i)：MedChemExpress，货号HY-124861
N-乙酰-L-半胱氨酸 (NAC)：MedChemExpress，货号HY-B0215
CellROX Deep Red 试剂：Invitrogen，货号C10491
Ferrostatin-1 (Fer-1)：Sigma-Aldrich，货号ST9H93D8
AZ-VAD-FMK：Sigma-Aldrich，货号ST9H9B
BOC-D-FMK：Sigma-Aldrich，货号ST9H9B
过氧化氢 (H2O2)：Sigma-Aldrich，货号H1009
丙酮酸：Sigma-Aldrich，货号P2256
RPMI 1640 培养基：Gibco，货号C11875
胎牛血清：Fuheng Biology，货号FH100-900

关键商业检测
铜 (Cu) 检测试剂盒（PAESA方法）：Autobio Diagnostics，货号6840–411
BCA 蛋白质检测试剂盒：Beyotime，货号P0011
SDS-PAGE 试剂盒：Epizyme Biotech，货号PG610
Western blot 抽提缓冲液：Servicebio，货号G2078

逆转录/qPCR 试剂：Takara，货号RR092
细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)：APExBIO，货号K1018
Annexin V-FITC/PI 染色试剂盒：BioLegend，货号640932
Propidium Iodide 溶液：BioLegend，货号421301
JC-1 线粒体膜电位检测试剂：Beyotime，货号c2003
酶联免疫印迹 (Enzymatic ChIP) 检测试剂盒：Beyotime，货号P2083

实验模型和研究参与者详情
- 从南昌大学第二附属医院的126名AML患者和76名健康对照组中获取了 peripheral blood 和骨髓样本。AML的诊断依据是既定的临床和血液学标准。
- 该研究得到了南昌大学第二附属医院医学伦理委员会的批准。
- 由于本研究是回顾性的，并使用了存档的、去标识化的临床样本和数据，因此免除了知情同意的要求。
- 从临床记录中收集了包括年龄和性别在内的人口统计信息。分析组之间在年龄或性别分布上没有观察到统计学上的显著差异，年龄和性别与我们的队列主要结果之间也没有统计学上的显著关联。

细胞系
- 人类AML细胞系THP1、HL60和U937来自美国类型培养 kolection (ATCC)。
- MOLM13和NB4来自Fuheng Biology。细胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养，温度为37°C，环境为含有5% CO2的湿润气氛。
- 所有细胞系均通过短串联重复序列 (STR) 分析进行鉴定，并定期检测支原体污染，所有检测结果均为阴性。

小鼠模型
- 5–6周大的NSG小鼠来自GemPharmatech。研究中使用了雄性和雌性小鼠。
- 通过尾静脉注射表达萤光素酶的MOLM13细胞（每只小鼠5 × 10^5个细胞）来建立AML异种移植模型。在通过生物发光成像确认成功植入后，小鼠被分配到指定的实验组，并每周三次接受PBS、elesclomol（10 mg/kg）、ME1抑制剂（50 mg/kg）或其组合的处理。
- 通过连续的生物发光成像监测白血病进展，并记录小鼠的存活情况。骨髓细胞通过Wright–Giemsa染色进行检测。
- peripheral blood中的血红蛋白水平使用自动化血液分析仪测量。此外，还使用Mindray分析仪测量了ALT、尿素和肌酐的水平。
- 所有动物实验均获得了南昌大学动物护理委员会（批准编号NCULAE-20221031186）的批准，并按照机构指南和适用的动物研究法规进行。

方法详情
- 血清铜水平
- 使用血清收集管从AML患者和健康对照组中收集新鲜的外周血样本。凝固后，以4,000 rpm的速度离心分离血清。血清铜浓度使用基于PAESA方法的商业铜 (Cu) 检测试剂盒（Autobio Diagnostics Co., Ltd., Zhengzhou, China）进行测量。该检测基于铜离子与发色试剂3,5-DiBr-PAESA在酸性条件下的反应，形成颜色复合物，其吸光度与铜浓度成正比。
- 每个反应孔/管中加入200 μL Reagent 1，然后加入12 μL去离子水作为空白对照，12 μL铜校准剂进行校准反应，或12 μL血清样本进行测试反应。混合后，在37°C下孵育5分钟，记录初始吸光度值A1。接着加入50 μL Reagent 2，再在37°C下孵育5分钟。最终吸光度值A2在570 nm的主波长下使用Mindray自动化生物分析仪（BS-2800M）记录。吸光度变化计算为ΔA = A2 ? A1。血清铜浓度根据以下公式计算：
Cu浓度 = ΔA样本 / ΔA校准剂 × 校准剂浓度
- 在样本测量前使用空白对照和铜校准剂生成校准曲线（图S1）。
- 每次运行都分析了商业质量控制材料，只有当对照值在实验室预设范围内时才接受结果。所有血清样本在相同的反应条件下进行测量。

试剂
- Elecsclomol (ES) (S1052, Selleck, USA)、CuCl2 (751944, Sigma-Aldrich, USA)、四硫钼酸盐 (TTM, 323446, Sigma-Aldrich, USA)、ME1酶抑制剂 (ME1i) (HY-124861, MCE, NJ, USA)、N-乙酰-L-半胱氨酸 (NAC, HY-B0215, MCE, USA)。

Western blotting (WB) 和 qRT-PCR
- 使用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，并加入磷酸酶和蛋白酶抑制剂（Beyotime），然后使用BCA蛋白质检测试剂盒（Beyotime）量化蛋白质浓度。Western blotting (WB) 分析使用了针对FDX1 (T510671, Abmart)、DLAT (#12362, CST)、硫辛酸 (ab58724, Abcam)、p53 (#9282, CST)、ME1 (TD4217, Abmart)、γ-H2AX (M63324, Abmart) 的抗体，以及β-actin (66009-1-Ig, Proteintech) 作为加载对照。等量的蛋白质通过SDS-PAGE试剂盒（Epizyme Biotech）分离，转移到PVDF膜上，并与相应的Primary抗体和HRP标记的Secondary抗体孵育。使用增强化学发光法可视化信号。
- 在检测到第一个目标蛋白后，使用Western blot strip buffer (Servicebio, G2078) 在室温下脱膜10分钟，然后用TBST洗涤，封闭，再与针对其他目标蛋白的Primary抗体孵育，随后加入相应的Secondary抗体。

总RNA提取使用RNA分离试剂盒（Beyotime），RNA浓度使用NanoDrop 2000分光光度计测量。使用逆转录试剂盒（Takara, Japan）将RNA逆转录为cDNA。定量PCR使用SYBR Green qPCR试剂（Takara, Japan）在Bio-Rad实时PCR系统上进行。循环条件包括初始变性95°C 30秒，随后40个循环，每个循环95°C 5秒和60°C 30秒。基因表达水平根据qPCR获得的Ct值计算。所有引物由Sangon Biotech（上海，表S1）合成。

免疫组化染色 (IHC) 和苏木精-伊红 (HE) 染色
- 骨髓涂片经过有效的内源性过氧化物酶活性阻断后，依次与Primary抗体、反应增强剂和标记有兔抗鼠/兔IgG的聚合物孵育。通过应用DAB实现显色，然后使用苏木精进行核染色。

质粒和转染
- 携带FDX1或ME1敲低和过表达结构的慢病毒载体来自Genechem（上海，中国）。通过慢病毒感染生成稳定转导的细胞系，然后使用嘌呤霉素（5 μg/mL）或新霉素（600 μg/mL）进行严格筛选。这些结构中使用的靶标序列详见表S1。转导效率通过qPCR和Western blot验证。

细胞活力
- 将细胞以1 × 10^4个细胞的密度接种在96孔板上，并用ES-Cu和/或其他试剂处理48小时。然后向每个孔中加入10 μL CCK-8溶液（APExBIO, USA）并轻轻混合。将板子在含5% CO2的湿润孵育器中在37°C下孵育2小时。使用微孔读数仪在450 nm处测量吸光度值，以评估细胞活力并进行统计分析。

流式细胞术
- 使用Annexin V/PI染色试剂盒（Biolegend, USA）评估细胞死亡。AML细胞通过2,000 rpm离心5分钟，用冷PBS洗涤两次，然后重新悬浮在100 μL Annexin V结合缓冲液中。细胞在室温下用5 μL APC标记的Annexin V和5 μL Propidium Iodide溶液染色15分钟。离心后，细胞重新悬浮在500 μL Annexin V结合缓冲液中，并使用Agilent流式细胞仪进行分析。

透射电子显微镜 (TEM)
- 细胞在2.5%戊二醛溶液中固定24小时。之后，用1%锇酸溶液进一步固定2小时。脱水、包埋和切片后，使用透射电子显微镜（Hitachi, H-7650, Japan）进行染色和观察。

线粒体膜电位
- 使用JC-1工作溶液（Beyotime, Shanghai, China）对细胞进行染色，并在37°C下孵育20分钟，然后用专门针对JC-1染色的缓冲液洗涤两次。JC-1聚集体和单体通过共聚焦显微镜捕获，JC-1聚集体的荧光通过流式细胞术量化。

RNA测序和生物信息学分析
- 使用Trezol试剂（Takara）提取总RNA，然后用DNase I处理。得到的RNA文库在Illumina测序平台（Illumina, San Diego, CA）和Oebiotech（上海，中国）上进行测序，生成150 bp的 Pair-end reads。使用完整的排名基因列表进行基因集富集分析（GSEA）。基因根据其在不同组间的差异表达统计数据进行了排名，并根据所有检测到的基因的全球排名来评估预定义基因集的富集情况。对于差异表达基因的传统功能注释，满足|logFC| > 1.5预设阈值的基因使用DAVID数据库进行了基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。公开可用的数据集来自GEO数据库和TCGA数据库。在R版本3.6.3中进一步进行了单样本GSEA（ssGSEA），以计算单个样本的通路富集分数。

**染色质免疫沉淀（ChIP）**
ChIP实验使用的是酶促ChIP测定试剂盒（Beyotime，上海，中国）。细胞样本经过交联、裂解和超声处理。使用针对p53的特异性抗体（#9282，CST）进行染色质分级免疫沉淀，并以IgG作为对照。随后，利用Protein A/G磁珠分离蛋白质-DNA复合物。所得到的纯化DNA通过表S1中指定的引物进行qPCR分析。

**线粒体分离及NAD+/NADH测定**
使用线粒体分离试剂盒（Beyotime，上海，中国）从AML细胞中分离线粒体，并按照制造商的说明，使用NAD+/NADH测定试剂盒（Beyotime，上海，中国）定量分离线粒体中的NAD+水平。

**定量与统计分析**
统计分析使用GraphPad Prism 10.0软件进行。除非另有说明，定量数据以平均值±标准差（mean ± SD）表示。对于体外实验，n代表生物学上独立的实验次数，至少进行了三次独立实验。对于人类和动物研究，n分别代表生物学上独立的参与者或动物数量。确切的样本量和n的定义在相应的图例中提供。为了评估统计显著性，我们采用双尾Student's t检验比较两组之间的差异，对于涉及多组的比较，则使用单因素方差分析（ANOVA）后进行多重比较检验。生存分析使用Kaplan–Meier曲线进行。p值小于0.05被认为具有统计显著性。

**其他资源**
不适用。

**补充信息（1）**
PDF文件（1.08 MB）
文档S1：图S1–S3和表S1–S3