7,8-二羟基黄酮对衣霉素诱导小鼠内质网应激、TXNIP/NLRP3相关炎症及氧化应激标志物的影响

《Current Issues in Molecular Biology》：Effects of 7,8-Dihydroxyflavone on ER Stress, TXNIP/NLRP3 and Inflammation Related Markers in Tunicamycin-Treated Mice

　　

背景：内质网（ER）应激通过自噬、凋亡和炎症通路调控细胞命运。研究人员探讨了7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）对内质网应激相关炎症反应的影响，并考察其与硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）/NLRP3（NOD样受体家族pyrin结构域包含3）信号通路相关蛋白改变之间的关联。材料与方法：30只雄性C57BL/6小鼠分为三组（n = 10）。通过单次腹腔注射衣霉素（TUN，0.5 mg/kg）诱导内质网应激。治疗组在TUN给药后接受7,8-DHF（5 mg/kg/day）治疗21天，对照组接受溶剂。采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测GRP78（葡萄糖调节蛋白78）、CHOP（CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白）、TXNIP和NLRP3蛋白表达。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清IL-1β（白细胞介素-1β）和IL-18（白细胞介素-18）水平，并用分光光度法评估氧化应激标志物（SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）和MDA（丙二醛））。结果：TUN显著升高GRP78、TXNIP、NLRP3、IL-1β、IL-18和MDA水平。与TUN组相比，7,8-DHF治疗显著降低CHOP、TXNIP、NLRP3、IL-1β、IL-18和MDA水平。此外，7,8-DHF治疗后CAT活性显著升高。结论：总体而言，这些发现提示DHF减轻了TUN相关的内质网应激、氧化应激和炎症标志物改变。然而，仍需进一步分子研究以阐明其潜在机制。

研究背景：内质网（ER）应激是细胞对蛋白折叠、Ca²⁺处理及脂质和类固醇合成等功能受挑战时产生的反应；营养供应改变、缺氧、氧化失衡、分泌需求增加或影响ER功能的突变可致未折叠或错误折叠蛋白积聚并引发ER应激。其主要适应性反应为未折叠蛋白反应（UPR），旨在重建ER稳态；若应激未解决，持续UPR信号可启动炎症和细胞死亡通路。该转变与肥胖、糖尿病、炎症性肠病（IBD）、神经退行性疾病和癌症等相关。NLRP3（NOD样受体家族pyrin结构域包含3）炎症小体响应多种细胞紊乱并参与IL-1β（白细胞介素-1β）和IL-18（白细胞介素-18）成熟；钾外流、活性氧（ROS）增加、细胞内Ca²⁺紊乱和溶酶体损伤等与NLRP3激活相关。既往研究将ER应激与NLRP3信号及硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）联系起来：氧化条件下TXNIP从硫氧还蛋白释放而与NLRP3关联，提供从氧化还原失衡到炎症小体激活的潜在分子途径；ER应激可增加TXNIP表达，TXNIP依赖信号可促进炎症小体活性。TXNIP表达改变见于代谢、肾脏和神经退行性疾病，包括1型和2型糖尿病。天然活性化合物因此被研究作为氧化应激、炎症、凋亡和ER功能障碍通路的潜在调节剂。7,8-二羟基黄酮（7,8-DHF）是一种黄酮，被报道为原肌球蛋白受体激酶B（TrkB）激动剂并模拟脑源性神经营养因子（BDNF）的若干作用；BDNF本身半衰期短和血脑屏障通透性有限。实验研究将神经营养、代谢、抗氧化和抗凋亡作用归于7,8-DHF；作者既往 cafeteria diet（自助餐饮食）诱导代谢综合征研究中，7,8-DHF治疗与ER应激和炎症减轻及代谢改变改善相关。上述证据提出7,8-DHF能否改变实验性诱导ER应激相关炎症信号的问题，因此本研究在衣霉素（TUN）处理小鼠中评估7,8-DHF对ER应激和炎症相关生物标志物的影响；作者假设7,8-DHF会减轻这些ER应激相关反应，且变化伴随TXNIP和NLRP3蛋白水平改变。研究人员将30只雄性C57BL/6小鼠分为对照、TUN和7,8-DHF三组（n = 10）；TUN单次腹腔注射（0.5 mg/kg）诱导ER应激，7,8-DHF组于TUN后48 h起腹腔注射7,8-DHF（5 mg/kg/day）21天，对照接受溶剂。研究显示TUN显著增加GRP78、TXNIP、NLRP3、IL-1β、IL-18和MDA水平；7,8-DHF显著降低CHOP、TXNIP、NLRP3、IL-1β、IL-18和MDA水平，并显著增加CAT活性。作者结论认为DHF减轻TUN相关的ER应激、氧化应激和炎症标志物改变，但需进一步分子研究阐明潜在机制。其意义在于作者提出这些观察支持ER应激与炎症信号之间的潜在关系，并提示7,8-DHF可能是ER应激诱导炎症疾病的潜在治疗剂；在代谢综合征、糖尿病、神经退行性疾病和IBD等ER应激与炎症参与发病的情形中有前景，且鉴于TXNIP在多疾病中上调，开发作用于该蛋白的化合物对靶向治疗策略重要。

关键技术方法（≤250字）：研究样本来源于KTU Faculty of Medicine Surgical Research Center，为6–8周龄雄性C57BL/6小鼠，30只分为三组（n = 10）。关键技术包括：蛋白免疫印迹（Western blot）检测肝匀浆GRP78、CHOP、TXNIP、NLRP3并以β-actin（β-肌动蛋白）归一化（每组6个代表性样本）；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清IL-1β和IL-18；分光光度法检测肝匀浆SOD、CAT活性和MDA水平；BCA（bicinchoninic acid，二辛可宁酸）法测定总蛋白；采用Shapiro–Wilk检验、单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验。

研究结果：
3.1 GRP78-CHOP与TXNIP-NLRP3蛋白结果分析（Analysis of GRP78-CHOP and TXNIP-NLRP3 Protein Results in Liver Homogenate）：通过Western blot检测肝匀浆，TUN组GRP78（葡萄糖调节蛋白78）显著高于对照（p = 0.033），CHOP（CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白）升高未显著（p = 0.085）；7,8-DHF组GRP78较TUN组降低但未显著（p = 0.068），CHOP显著降低（p = 0.049）。TUN组TXNIP和NLRP3显著高于对照（p = 0.022和p = 0.005），7,8-DHF组二者较TUN组显著降低（p = 0.009和p = 0.010）。
3.2 7,8-DHF对炎症状态的影响（Effect of 7,8-DHF on Inflammatory Conditions）：通过ELISA检测血清，TUN组IL-1β和IL-18显著高于对照（p = 0.006和p = 0.009）；7,8-DHF组较TUN组显著降低（p = 0.027和p = 0.01）。
3.3 7,8-DHF对氧化-抗氧化状态的影响（Effect of 7,8-DHF on Oxidant–Antioxidant Status）：通过分光光度法检测肝匀浆，MDA（丙二醛）在TUN组显著高于对照（p = 0.002），7,8-DHF组显著低于TUN组（p = 0.035）；SOD（超氧化物歧化酶）活性TUN组显著高于对照（p = 0.042）；CAT（过氧化氢酶）活性TUN组较对照降低但未显著（p = 0.072），7,8-DHF组CAT活性较TUN组显著升高（p = 0.006）。上述结果提示TUN诱导ER应激、炎症和氧化应激相关改变，7,8-DHF与CHOP、TXNIP、NLRP3、IL-1β、IL-18、MDA降低及CAT活性升高相关。

讨论部分总结：作者指出哺乳动物中ER应激、氧化应激和炎症反应构成帮助细胞适应和存活的主要防御网络，但慢性ER应激、氧化应激或炎症与多种人类疾病发生发展相关；ER应激诱导炎症是糖尿病、IBD、癌症、动脉粥样硬化、慢性肾炎、酒精性肝病、肝炎、胰腺炎、类风湿关节炎和神经退行性疾病等的病理基础。TXNIP是氧化还原传感器和内源性抗氧化抑制物，可由葡萄糖或ROS激活；ER应激时TXNIP经IRE1α（肌醇需求酶1α）快速激活，升高TXNIP触发NLRP3炎症小体表达，故TXNIP连接ER应激与NLRP3炎症小体激活。7,8-DHF作为BDNF模拟物和植物黄酮已被显示对ER应激和炎症有益。本研究观察到TUN处理小鼠ER应激标志物与TXNIP/NLRP3相关炎症蛋白同步改变；作者强调当前设计不能得出因果结论，但观察支持ER应激与炎症信号之间的潜在关系，并提示ER应激不限于蛋白折叠障碍，也激活炎症反应。UPR信号通路增加促炎细胞因子产生，尤其PERK（蛋白激酶R样内质网激酶）和IRE1α通路通过增加TXNIP表达触发NLRP3炎症小体激活。GRP78为ER应激传感器和启动者；TUN显著升高GRP78表明ER应激启动并试图适应性反应；CHOP升高未显著，作者认为这可能提示应激更多指向炎症反应而非细胞死亡。既往 cafeteria diet 研究中21天7,8-DHF降低GRP78和CHOP；本研究中7,8-DHF后GRP78和CHOP呈降低趋势，但并非全部比较达显著。TXNIP通过NLRP3激活炎症信号，多项研究报道ER应激诱导TXNIP支持NLRP3炎症小体激活；本研究中TUN组TXNIP、NLRP3显著升高，7,8-DHF显著降低；TXNIP作为硫氧还蛋白系统负调控因子破坏氧化还原平衡并增加ROS，为NLRP3激活创造氧化应激环境；血清IL-1β、IL-18升高证实系统性炎症反应并可能参与组织损伤。Oslowski et al. 显示ER应激参与炎症小体激活，TXNIP在ER应激介导IL-1β上调和成熟中重要；另一研究显示ER应激通过ROS/ERK（细胞外信号调节激酶）和ROS/TXNIP通路激活NLRP3，外源性硫化氢减少NLRP3介导的肝细胞炎症。由于未直接评估PERK/eIF2α（真核起始因子2α）和IRE1α/XBP1（X盒结合蛋白1）通路，不能确定具体ER应激分支。ER应激重要效应之一是氧化应激增加。TXNIP生理位于细胞核；过量ROS通过抑制AMPK（AMP活化蛋白激酶）磷酸化及TXNIP核转位上调TXNIP，导致ER和线粒体应激；TXNIP与TRX1（硫氧还蛋白1）互作抑制TRX1活性并参与疾病。本研究中TUN增加MDA、7,8-DHF降低MDA，提示脂质过氧化和细胞膜损伤增加及7,8-DHF降低脂质过氧化；SOD活性升高提示抗氧化防御激活但作者认为不足。作者提醒氧化应激结果需谨慎解释：CAT变化不显著且未直接测ROS相关通路限制机制解释，数据仅提示7,8-DHF治疗与脂质过氧化降低相关，不能确定经TXNIP信号介导。ROS可使TXNIP与NLRP3结合致炎症小体激活；TXNIP基因缺失通过抑制氧化应激和凋亡对脊髓神经毒性提供保护。作者据此提出7,8-DHF可能是ER应激诱导炎症疾病的潜在治疗剂，在代谢综合征、糖尿病、神经退行性疾病和IBD等中有前景；鉴于TXNIP在多疾病中上调，开发作用于该蛋白的化合物对靶向治疗重要。作者列出局限性：未设单独7,8-DHF治疗组，无法评估基础状态下独立效应；ER应激由单次TUN诱导且未多时间点评估标志物，不能确定TUN诱导ER应激在治疗期的时间持续性；虽TXNIP、NLRP3蛋白及循环IL-1β、IL-18变化支持关联，但设计不能建立直接因果机制，且未进行TXNIP或NLRP3特异性抑制或基因操作；仅雄性小鼠限制推广；需增加对照、时间进程和直接机制研究，并用ER应激抑制剂如4-PBA（4-苯基丁酸）或TUDCA（牛磺熊去氧胆酸）或TXNIP/NLRP3通路抑制剂如MCC950（NLRP3抑制剂）确认因果作用；氧化应激仅用SOD、CAT、MDA生化指标，未评估氧化应激相关基因和蛋白，未来需基因和蛋白表达分析。

研究结论（翻译）：当前研究结果提示，在衣霉素诱导的小鼠模型中，7,8-DHF治疗与炎症及内质网应激相关标志物的减轻相关。TXNIP和NLRP3蛋白水平降低，伴随循环IL-1β和IL-18水平下降及氧化应激参数改善，表明7,8-DHF的作用可能与TXNIP/NLRP3通路调节相关。然而，鉴于实验设计的局限性，这些发现不应被解释为确立了7,8-DHF与TXNIP/NLRP3炎症小体抑制之间的直接因果关系。需要进一步机制研究以确认这些观察并阐明7,8-DHF作用所涉及的途径。