从膳食蛋白到抗病毒肽：机器学习引导的H5N1流感聚合酶靶向肽发现与结构评估

《Current Issues in Molecular Biology》：From Dietary Proteins to Antiviral Peptides: Machine Learning-Guided Discovery and Structural Evaluation Against H5N1 Influenza Polymerase

　　

食物蛋白是众所周知的生物活性肽来源，但其对流感H5N1聚合酶的抑制活性尚未被广泛研究。研究人员应用计算流程预测食物来源肽对H5N1聚合酶PB1亚基的抗病毒活性。研究人员分析了大豆、牛乳、鸡蛋、豌豆、玉米、水稻和豇豆来源的19种蛋白质的理化性质、致敏性、抗菌活性和溶血活性，并利用胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶进行计算机模拟消化。研究人员使用四种不同的机器学习算法（SVM、Random Forest、IBk和K-Star）根据抗病毒活性对每种消化过程产生的肽进行排序，并基于多种模型的一致性以及胃肠道释放和非溶血特性进行优先排序。所选肽段在三个独立对接服务器（HawkDock、PatchDock和pyDockWEB）上与PB1蛋白进行分子对接，并通过相互作用分析和200.4 ns分子动力学（MD）模拟进一步分析。部分蛋白表现出较高的抗菌活性评分，如legumin A（0.970）、β-conglycinin α亚基（0.941）和glutelin type-A 1（0.911）。大多数蛋白与已知过敏原相似。在抗病毒特性和对接方面表现出一致结果的肽包括RIQQAIAAGILPLSPL、SSAVSSVCENPILQPY和QPYRIQQAI-AAGILPL，尽管两个平台对其功效的排序不同。肽SSAVSSVCENPILQPY是进一步研究最一致的候选肽，具有29个紧密接触和4个氢键。此外，其与PB1形成的复合物在整个模拟期间保持稳定。这些结果能够识别出供进一步研究的候选肽，但所有结果均仅基于计算分析，仍需实验验证。

### 论文解读

#### 一、研究背景与意义

流感A型病毒因其遗传变异性、适应能力和跨物种传播能力，持续对人类和动物健康构成威胁。H5N1亚型因在禽类中广泛存在并具有感染包括人类在内的哺乳动物的能力而备受关注。自2021年以来，2.3.4.4b分支病毒已在全球传播，并从欧洲和亚洲扩展至南北美洲等此前未受影响的地区。据世界卫生组织（WHO）统计，自2003年以来约有900例实验室确诊的H5N1人类感染病例，其中半数死亡。尽管尚未观察到人传人现象，但H5N1在不同动物宿主中的持续循环为病毒基因变化提供了机会，凸显了开发补充性抗病毒策略的必要性。

流感病毒复制主要依赖由PA、PB1和PB2三个亚基组成的RNA聚合酶复合物。PB1作为催化亚基，携带RNA依赖性RNA聚合酶活性位点，并形成连接PB2和PA的结构核心，是肽段结合的理想结构靶点。研究发现，宿主蛋白ANP32B可作为辅助因子结合聚合酶复合物，通过PB1和PA亚基与之相互作用，帮助复合物的稳定、组装和构象优化。因此，聚合酶-ANP32B相互作用界面成为潜在药物靶点，干扰这一宿主-病毒相互作用可为抗流感药物开发提供新机制。与此同时，食物来源的生物活性肽因天然可得性、结构多样性和生物相容性而受到广泛关注，但尚无研究对食物源肽与H5N1聚合酶复合物的相互作用进行计算分析。基于此，本研究旨在通过纯计算方法探索能否从食物蛋白中筛选出与H5N1聚合酶相互作用的候选肽段。

#### 二、研究内容概述

研究人员以H5N1聚合酶-ANP32B复合物为生物学基础，选取H5N1聚合酶的PB1亚基作为对接结构靶点，构建了人工智能驱动的多步骤计算流程。从大豆、牛乳、鸡蛋、豌豆、玉米、水稻和豇豆中选取19种蛋白质，经过理化性质分析、致敏性评估、抗菌和溶血活性预测、计算机模拟消化、机器学习抗病毒活性预测、多准则排序、分子对接和分子动力学模拟，最终筛选出具有进一步研究价值的候选抗病毒肽。研究发现SSAVSSVCENPILQPY为最一致的候选肽，其复合物在模拟期间保持稳定，为后续实验验证提供了明确方向。

#### 三、关键技术方法

研究人员从UniProt数据库获取19种食物蛋白序列（涵盖大豆glycinin G3/G4与β-conglycinin α亚基、牛乳β-乳球蛋白与四种酪蛋白、鸡蛋卵清蛋白、豌豆vicilin与legumin、玉米zein与glutelin、水稻glutelin、豇豆vicilin）；以ProtParam计算理化参数，AllerCatPro 2.0预测致敏性，Macrel v1.4.0预测抗菌和溶血活性；以MS-Digest用胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶模拟消化；用AVP-IC50Pred的SVM、Random Forest、IBk、K-Star四种算法预测IC50值并以多模型共识排序；以H5N1聚合酶-人ANP32B复合物晶体结构（PDB ID: 8R1J）为模板经SWISS-MODEL建模，ProSA-web和SAVES v6.1评估后选PB1为对接受体；用HawkDock、PatchDock、pyDockWEB进行分子对接，COCOMAPS 2.0和LIGPLOT分析相互作用；用Desmond在310 K、NPT系综下进行200.4 ns分子动力学模拟。

#### 四、研究结果

**3.1 所选食物蛋白的理化性质。** ProtParam分析显示，19种蛋白长度为178-605个氨基酸，分子量为19,883.25-70,306.21 Da，理论pI为4.93-9.09；除zein-alpha GZ19AB11外均为亲水性蛋白，且大多预测为不稳定蛋白。

**3.2 所选食物蛋白的致敏性谱。** AllerCatPro 2.0预测显示，除legumin B（弱证据）和zein-alpha GZ19AB11（无证据）外，其余17种蛋白均被归类为具有"强证据"致敏性，与这些蛋白作为主要食物过敏原的认识一致。

**3.3 所研究蛋白的抗菌与抗溶血特性。** Macrel预测显示，12种蛋白为抗菌肽阳性，其中legumin A（0.970）、β-conglycinin α亚基（0.941）和glutelin type-A 1（0.911）概率最高，而五种乳蛋白的抗菌概率均为0.000；仅glutelin-2（0.545）被预测为溶血性，其余蛋白均为非溶血性。

**3.4 计算机模拟消化与生物活性肽候选鉴定。** 胰凝乳蛋白酶模拟消化产生8-21个氨基酸残基的肽段（m/z 806.4-2120.3870），胃蛋白酶模拟消化产生7-13个残基的肽段（m/z 847.3978-1192.5514），两者存在序列重叠。

**3.5 候选肽的抗病毒、抗菌和溶血谱预测与优先排序。** 四种机器学习算法预测显示，QPYRIQQAIAAGILPL、TQCSQAPIASLLPPY、SSAVSSVCENPILQPY和RIQQAIAAGILPLSPL具有相对良好的IC50预测值；但部分肽段预测值差异显著（如ALTNPAVF的K-Star值为0.05 μM，其他算法值明显更高），提示需采用多模型共识排序。所有候选肽均预测为非溶血性，多数抗菌活性较低。

**3.6-3.7 H5N1聚合酶亚基与ANP32B的结构预测。** PSIPRED二级结构预测显示四种蛋白均以α螺旋为主；ProSA-web Z-score（PA -8.29、PB1 -9.51、PB2 -9.64、ANP32B -7.84）均处于实验解析结构的正常范围；Ramachandran图分析显示PB1是唯一允许区域残基比例≥90%（90.8%）的亚基，因此被选为对接受体。

**3.8 分子对接数据。** HawkDock中RIQQAIAAGILPLSPL结合能最低（-3663.38）；pyDockWEB中SSAVSSVCENPILQPY与RIQQAIAAGILPLSPL能量最负（-29.537）；PatchDock中TQCSQAPIASLLPPY的ACE评分最优（-448.58）。原子相互作用分析显示，SSAVSSVCENPILQPY具有最多紧密接触（29个）和4个氢键。

**3.9 动力学模拟参数。** 200.4 ns分子动力学模拟显示，SSAVSSVCENPILQPY-PB1复合物在模拟后期保持稳定的氢键网络、回转半径（稳定于8.3-8.6 ?）和溶剂可及表面积，提示该复合物具有稳定的动态构象。

#### 五、讨论与结论

讨论部分指出，本研究并非开发全新的计算工具，而是将成熟方法整合到食物源肽发现框架中，专门用于H5N1聚合酶靶向肽的鉴定与优先排序。机器学习算法间预测值的差异源于各算法对训练数据集和特征的不同敏感性，因此多模型共识方法对候选肽的可靠排序至关重要。肽段理论上可通过结合ANP32B-聚合酶相互作用位点干扰病毒复制，但因ANP32B是参与细胞正常功能的宿主蛋白，需实验验证肽段的选择性。所有结果均为计算预测，须视为假设而非活性证据。

研究结论表明，多步骤计算流程将19种食物蛋白缩减为少数候选肽段。RIQQAIAAGILPLSPL、SSAVSSVCENPILQPY和QPYRIQQAIAAGILPL具有最令人信服的计算数据（良好的预测IC50值和良好的PB1对接结果），三个对接平台排序虽不一致，但SSAVSSVCENPILQPY在每个平台上均位列较长肽段的前三名，且在对接姿势中形成最多紧密接触（29个）和4个氢键，复合物在模拟后期保持稳定，因此为最一致的候选肽。所有结果仅基于计算分析，肽段的合成和体外实验验证是下一步研究的关键。