EPHB4靶向CAR-T细胞在口腔鳞状细胞癌原位舌PDX模型中的抗肿瘤活性研究

《Current Issues in Molecular Biology》：EPHB4-Targeted CAR-T Cells Demonstrate Antitumor Activity in an Orthotopic Tongue PDX Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

　　

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）尽管接受多模式治疗，仍与不良预后和功能障碍相关，这凸显了对有效且创伤较小的治疗策略的需求。Ephrin type-B受体4（EPHB4）在OSCC细胞上频繁表达，是嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）-T细胞治疗的潜在靶点。本研究利用体外细胞毒性实验评估了EPHB4靶向CAR-T细胞（131CAR）对OSCC细胞系HSC-4的抗肿瘤活性，并在NOD scid gamma（NSG）小鼠中建立了源自OSCC肿瘤（OC-15）的原位舌患者来源异种移植（patient-derived xenograft, PDX）模型。流式细胞术证实HSC-4细胞（约90%）和OC-15来源肿瘤细胞（约68%）中EPHB4的表达。体外实验表明，131CAR对HSC-4细胞具有效应细胞与靶细胞比例依赖性的细胞毒性。在主要体内实验中，瘤内给予131CAR可抑制肿瘤生长，并显著减少细胞角蛋白（cytokeratin）定义的癌区域面积，与对照组相比差异显著。数字病理学进一步显示，131CAR治疗组肿瘤残余癌区域内EPHB4阳性区域比例降低，人CD8+细胞积累增加。这些发现表明，EPHB4靶向CAR-T细胞在原位OSCC模型中发挥抗肿瘤活性，并支持该治疗方法在解剖学相关环境中进一步开展临床前评估。

论文解读：EPHB4靶向CAR-T细胞在口腔鳞状细胞癌原位舌PDX模型中的抗肿瘤活性

一、研究背景与目的

口腔癌是头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）中最常见的恶性肿瘤之一。2022年全球估计新增约38.9万例病例和18.8万例死亡。其中超过90%的口腔癌被诊断为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）。尽管手术、放疗和化疗相结合的多模式治疗策略改善了疾病管理，但OSCC患者的预后仍不理想。由于口腔解剖结构的复杂性和功能重要性，治疗常导致言语和吞咽等关键口腔功能受损。因此，迫切需要既能实现持久肿瘤控制、又能最大限度减少治疗相关并发症并保留口腔功能的新型治疗策略。

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）已在多种恶性肿瘤中显示出临床疗效。在包括OSCC在内的HNSCC中，ICIs相比传统全身治疗改善了复发或转移性疾病患者的总生存期。嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptor T-cell, CAR-T）疗法也已在HNSCC中积极探索。然而，CAR-T疗法在实体瘤中的临床应用仍受多种障碍限制，包括抗原异质性、肿瘤部位内浸润和持久性不足，以及免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）导致的功能损伤。因此，要使CAR-T疗法在OSCC中有效，识别在肿瘤细胞表面频繁表达且定位于细胞膜上的靶分子，并制定最大化瘤内可及性的递送策略至关重要。

Ephrin type-B受体4（EPHB4）属于Eph受体家族的受体酪氨酸激酶，参与肿瘤进展、侵袭和血管生成。在OSCC中，EPHB4频繁过表达，免疫组织化学分析报告所有受检病例（20/20）均呈高阳性率。EPHB4在OSCC中的相对较高表达及其在肿瘤细胞膜上的定位，支持其作为抗体或CAR介导识别的有前景靶点。Yagyu等人利用EPHB4的生理配体ephrin-B2（EFNB2）开发了EPHB4靶向CAR-T细胞，Ito等人在OSCC细胞系和患者来源异种移植（patient-derived xenograft, PDX）模型中报道了有前景的抗肿瘤疗效。然而，其临床前评估主要基于皮下肿瘤模型，可能无法充分反映口腔的解剖约束，包括独特的血管和淋巴结构、局部TME以及决定CAR-T细胞可及性的给药途径因素。

本研究采用源自MAb131的scFv构建的EPHB4靶向CAR（131CAR），在由OC-15建立的原位舌PDX模型中，以瘤内给药作为主要治疗途径进行评估，从而在解剖学相关原位舌模型中验证了不同的CAR构建策略。

二、主要技术方法

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用流式细胞术检测HSC-4细胞系和OC-15 PDX来源肿瘤细胞的EPHB4表面表达水平；通过逆转录病毒载体系统制备表达dNGFR标签的131CAR-T细胞及仅表达dNGFR的对照T细胞，使用健康供者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）作为T细胞来源；采用TeraScan VPC系统进行体外细胞毒性实验；通过机械解离和过滤制备OC-15 PDX肿瘤细胞悬液，经舌内注射建立原位舌PDX模型，并使用NOD scid gamma（NSG）小鼠；通过免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）染色和数字病理图像分析（Fiji/ImageJ软件）定量评估肿瘤面积、EPHB4阳性区域比例及人CD8阳性细胞浸润。

三、研究结果

3.1 EPHB4分子结构与抗EPHB4 CAR-T细胞的生成

EPHB4胞外区包含ephrin结合域、富含半胱氨酸区域和两个纤连蛋白III型样结构域（FN1和FN2）。本研究使用的抗EPHB4 CAR为第二代构建体，包含源自MAb131的scFv，该scFv已被报道结合EPHB4的FN1结构域。

3.2 HSC-4细胞EPHB4表达及131CAR T细胞体外细胞毒性活性

通过dNGFR染色评估转导效率，确认50%至80%的CD8阳性和CD4阳性细胞表达细胞表面dNGFR，且dNGFR表达与重组人EphB4蛋白结合相关。流式细胞术显示约90%的HSC-4细胞为EPHB4阳性。将HSC-4细胞与效应细胞以不同效靶比共培养6小时后，131CAR T细胞表现出剂量依赖性细胞毒性，在10:1效靶比时平均细胞毒性为82.6%，而dNGFR对照T细胞为29.3%。长期细胞毒性实验显示对EPHB4表达水平更高的细胞具有更强的裂解活性。

3.3 患者来源OSCC细胞EPHB4表达及原位舌PDX模型的建立

流式细胞术确认OC-15肿瘤来源细胞表达细胞表面EPHB4。研究人员发现酶消化法导致极低的成瘤率，而通过机械解离和过滤制备的肿瘤细胞悬液经舌内注射实现了稳健的肿瘤植入，所有后续治疗实验均采用此原位荷瘤模型。

3.4 EPHB4-CAR-T细胞在原位舌PDX模型中的体内抗肿瘤活性

小鼠在肿瘤植入后第3天接受1.5 Gy全身照射，第4天和第6天接受瘤内注射dNGFR对照T细胞或131CAR T细胞。第17天，由于无治疗组和dNGFR对照组部分小鼠出现约25%体重下降，所有动物在 humane endpoint 处死。无治疗组和dNGFR对照组小鼠显示舌肿瘤随时间进行性宏观增大，而131CAR治疗组中仅有一只小鼠在第10天观察到宏观舌肿瘤，其余四只未检测到宏观肿瘤，第14天后所有小鼠均无宏观舌肿瘤。131CAR治疗组平均体重在第6天后未出现明显下降，反而逐渐增加。探索性静脉给药OC-15 PDX队列和UPCI:SCC152细胞原位模型中，131CAR-T治疗均显示对舌肿瘤生长的抑制。

3.5 免疫组织化学病理学评估

组织病理学评估显示，无治疗组和dNGFR对照组肿瘤区域显著，而131CAR治疗组肿瘤区域显著减少。EPHB4免疫反应性在无治疗组和对照组中清晰可检测，但在131CAR治疗组中减弱。细胞角蛋白染色强度基本保持不变，但阳性区域范围在131CAR治疗组中减少。131CAR治疗组癌区域周围观察到人CD8阳性（hCD8⁺）细胞聚集，而无治疗组和对照组中此类细胞聚集有限。

3.6 数字病理学定量分析

以细胞角蛋白阳性区域定义为肿瘤区域进行定量分析：131CAR治疗组肿瘤面积（0.325 ± 0.146 mm²）较无治疗组（16.2 ± 4.76 mm²）和dNGFR对照组（16.4 ± 5.58 mm²）显著减少。EPHB4阳性区域占细胞角蛋白阳性区域的比例在131CAR治疗组（1.07 ± 0.62%）显著低于无治疗组（37.67 ± 10.30%）和dNGFR对照组（27.97 ± 12.99%）。hCD8⁺细胞数量在131CAR治疗组（207.69 ± 65.39 cells/view）显著高于无治疗组（0.30 ± 0.18 cells/view）和dNGFR对照组（3.82 ± 4.08 cells/view）。

四、讨论与结论

本研究在原位舌PDX模型中评估了EPHB4靶向CAR-T细胞的抗肿瘤活性，扩展了既往基于皮下模型的研究发现，在更接近临床微环境的解剖学相关环境中证实了肿瘤控制效果。131CAR采用MAb131来源的scFv，与既往使用EFNB2配体的构建策略不同，需要考虑on-target/off-tumor毒性。由于131CAR识别人EPHB4但对鼠EphB4交叉反应有限，NSG异种移植模型不适合对on-target/off-tumor毒性进行确定性评估。

原位舌PDX模型的建立通过机械解离和过滤制备细胞悬液，避免了体外培养步骤，减少了培养相关表型变化和克隆选择，更好地保留了瘤内异质性。与皮下模型相比，原位舌模型更接近地再现了OSCC的位点特异性肿瘤微环境、血管和淋巴结构以及局部生长模式。

治疗后观察到EPHB4免疫反应性减弱，而细胞角蛋白阳性残余肿瘤区域仍可检测到，提示部分肿瘤成分持续存在。残余EPHB4低表达或阴性肿瘤群体可能导致单抗原CAR-T治疗的应答不完全。由于仅在实验终点评估EPHB4表达，无法确定该发现反映的是EPHB4高表达细胞的优先清除和预先存在的EPHB4低表达或阴性群体的相对富集，还是治疗后EPHB4表达的动态调节。

数字病理学分析证实131CAR治疗显著减少肿瘤面积、降低EPHB4阳性区域比例并增加hCD8⁺细胞浸润。临床上，口腔解剖学上易于接近，瘤内给药可在特定情况下考虑以实现高局部效应细胞密度并限制全身暴露。但瘤内给药可能不足以覆盖区域淋巴结疾病或隐匿性播散病灶，未来应考虑基于疾病分布选择给药途径，并合理设计局部与全身方法互补的组合策略。

研究局限性包括体内样本量较小、仅使用一个PDX模型、缺乏客观成像进行纵向肿瘤负荷评估、供者间变异性未充分评估，以及缺乏全面的机制分析和安全性评估。

研究结论：EPHB4靶向CAR-T细胞（131CAR）在体外对EPHB4高表达OSCC细胞表现出快速细胞毒性活性。在OC-15来源的原位舌PDX模型中，131CAR抑制了肿瘤生长。尽管治疗后观察到EPHB4免疫反应性减弱和细胞角蛋白阳性残余区域，但细胞角蛋白定义的肿瘤面积显著减少，支持131CAR的抗肿瘤疗效。这些发现为EPHB4靶向CAR-T细胞治疗OSCC的进一步临床前评估提供了概念验证证据。