ATM-KAT8-RPA1轴通过RPA1 K167乳酸化修饰调控DNA损伤修复与化疗耐药

《iScience》：Metabolic regulation of ATM-KAT8-RPA1 axis in DNA damage repair and chemoresistance

　　

翻译后修饰被认为是DNA损伤反应的关键调控因子。在本研究中，研究人员确定复制蛋白A1（replication protein A1，RPA1）——同源重组（homologous recombination，HR）修复的调控因子——在DNA损伤响应中于第167位赖氨酸（lysine 167，K167）发生乳酸化修饰。该修饰由组蛋白乙酰转移酶KAT8催化，并依赖于ATM介导的KAT8磷酸化。K167位点的乳酸化增强了RPA1的DNA结合能力，进而促进HR修复。抑制KAT8或乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）（后者可提高细胞内乳酸水平）可显著降低RPA1乳酸化水平，损害HR修复，并在患者来源异种移植（patient-derived xenograft，PDX）模型中增加肿瘤细胞对化疗的敏感性。此外，一种选择性破坏该修饰的细胞穿膜肽（cell-penetrating peptide，CPP）可使肿瘤对基因毒性治疗敏感。这些发现确立了RPA1乳酸化作为HR修复的关键调控因子，并揭示了一种通过靶向该修饰来克服化疗耐药的潜在治疗策略。

论文解读：ATM-KAT8-RPA1轴通过RPA1 K167乳酸化修饰调控DNA损伤修复与化疗耐药

一、研究背景与科学问题

DNA双链断裂（double-strand breaks，DSBs）是最具细胞毒性的DNA损伤形式之一，可由复制应激、电离辐射或化疗药物诱导产生。同源重组（homologous recombination，HR）是DSB修复最精确的机制，主要在S期和G2期通过姐妹染色单体作为模板进行。HR失调与肿瘤发生、进展及治疗耐药密切相关。复制蛋白A1（replication protein A1，RPA1）是异源三聚体RPA复合物的最大亚基，在复制和修复过程中对单链DNA（single-stranded DNA，ssDNA）的稳定至关重要。RPA1通过其多个寡核苷酸/寡糖结合折叠（OB-fold）结构域发挥功能，其中央OB-A和OB-B结构域直接结合ssDNA。RPA1可被磷酸化、SUMO化和泛素化等多种翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）调控，这些修饰精细调节RPA活性以确保HR保真度。近年来，赖氨酸乳酸化——一种由乳酸衍生的代谢调控性PTM——因其超越表观遗传调控的功能而受到关注。瓦伯格效应（Warburg effect）是癌症代谢的标志性特征，表现为即使在氧气充足条件下仍持续向有氧糖酵解转变并产生过量乳酸。近期研究已发现MRE11（MRN复合物的关键组分）可发生乳酸化并增强其DNA结合和HR活性，但乳酸化是否调控其他HR因子仍 largely unexplored。本研究旨在探讨RPA1是否受乳酸化调控及其在HR修复和化疗耐药中的作用机制。

二、研究内容与主要发现

研究人员发现RPA1在DNA损伤响应中于K167位点发生乳酸化修饰，该修饰由组蛋白乙酰转移酶KAT8催化，并依赖于ATM介导的KAT8磷酸化。K167乳酸化增强RPA1的DNA结合能力，促进其染色质装载和HR修复。抑制KAT8或乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）可降低RPA1乳酸化水平，损害HR修复，并在体外和患者来源异种移植（patient-derived xenograft，PDX）模型中增加肿瘤细胞对化疗的敏感性。此外，研究人员设计了一种细胞穿膜肽（cell-penetrating peptide，CPP）——K167-pe，可选择性阻断RPA1 K167乳酸化并增强化疗敏感性。这些发现揭示了连接瓦伯格效应与DNA损伤反应（DNA damage response，DDR）机制的信号轴，提示靶向RPA1乳酸化可能是克服HR功能健全肿瘤化疗耐药的有前景策略。

三、主要关键技术方法

本研究采用免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）结合免疫印迹（immunoblotting，IB）检测RPA1乳酸化水平；质谱（mass spectrometry，MS）分析鉴定乳酸化位点；体外乳酸化实验验证KAT8催化活性；GST pull-down和免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）验证蛋白相互作用；凝胶电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）评估DNA结合能力；激光微照射实验检测RPA1损伤位点募集；DR-GFP报告系统检测HR修复效率；免疫荧光（immunofluorescence，IF）分析RPA1焦点形成；细胞活力测定（CCK-8）和集落形成实验评估化疗敏感性；患者来源异种移植（PDX）模型进行体内药效验证。PDX模型肿瘤组织来源于中国医科大学附属第一医院一位63岁女性G3级乳腺癌患者（Ki67阳性，CerbB-2、ER、PR阴性，HR修复功能为野生型）。

四、研究结果

RPA1在DNA损伤响应中被KAT8乳酸化

研究人员发现RPA1可发生乳酸化，乳酸钠（sodium lactate，NALA）处理增加RPA1乳酸化水平而不影响其乙酰化，而LDH抑制剂（LDHi）则相反。LDHA/B敲低显著降低RPA1乳酸化。多种DNA损伤剂处理后RPA1乳酸化水平升高。通过筛选，研究人员鉴定KAT8为RPA1乳酸化的潜在乳酸转移酶。KAT8抑制剂（MG149）或KAT8敲低显著降低RPA1乳酸化水平。体外实验证实KAT8催化RPA1乳酸化而非乙酰化。Co-IP和GST pull-down实验证实RPA1与KAT8直接相互作用。SIRT6可能特异性介导RPA1去乳酸化。KAT8抑制减少DNA损伤后RPA1焦点形成并降低HR修复效率，且该效应依赖于RPA1。

RPA1在K167位点发生乳酸化修饰

质谱分析鉴定出RPA1四个潜在乳酸化位点（K88、K163、K167和K267）。点突变验证表明仅K167R突变显著降低RPA1乳酸化水平，确定K167为主要乳酸化位点。研究人员生成了特异性识别RPA1 K167乳酸化的抗体（RPA1-K167la），并验证其特异性。DNA损伤或KAT8过表达显著增加野生型RPA1而非K167R突变体的乳酸化水平。NALA处理增强DNA损伤后RPA1焦点形成，而KAT8i或LDHi处理逆转此效应并减少RPA1-K167la焦点形成。

RPA1 K167乳酸化增强其DNA结合能力

K167突变显著损害DNA损伤后RPA1焦点形成，并消除LDHi处理引起的焦点形成减少，表明K167乳酸化对RPA1高效募集至DNA损伤位点是必需的。RPA1 K167R突变体显示染色质结合减少。EMSA实验表明K167R突变体DNA结合活性弱于野生型。激光微照射实验证实K167R突变体向DNA损伤位点的募集显著受损。HR报告实验显示K167R突变体显著降低HR修复效率，NALA增强野生型RPA1的HR修复但对K167R突变体无效应，KAT8抑制仅降低野生型RPA1的HR修复效率。染色质分级实验表明K167R突变体细胞中RAD51募集受损，提示K167乳酸化促进HR过程中RPA被RAD51替换。

ATM介导的KAT8磷酸化促进DNA损伤后RPA1焦点形成

DNA损伤增强RPA1与KAT8的相互作用，ATM抑制逆转此效应，而DNA-PKcs或ATR抑制无影响。KAT8的S392位点符合ATM/ATR底物共有基序。DNA损伤诱导KAT8磷酸化，ATM抑制剂可消除该磷酸化。S392A突变消除DNA损伤诱导的KAT8磷酸化，而S386A无效应。体外激酶实验证实ATM以S392依赖方式磷酸化KAT8。ATM与KAT8的相互作用在DNA损伤后增强。KAT8 S392A突变显著降低KAT8与RPA1的相互作用，损害RPA1 K167la焦点形成并降低HR修复效率。

RPA1乳酸化增强癌细胞对化疗的耐药性

研究人员在多种乳腺癌细胞系中检测RPA1乳酸化水平，Hs578T和HCC1806细胞中水平较高。LDHi或KAT8i处理使乳腺癌细胞对奥拉帕利（olaparib，PARP抑制剂）敏感化，而NALA处理使SUM-159细胞对奥拉帕利耐药。RPA1 K167R突变细胞比野生型细胞对奥拉帕利更敏感，LDHi或KAT8i处理增加野生型细胞对奥拉帕利的敏感性但对K167R突变细胞无进一步效应。在乳腺癌PDX模型中，KAT8i或LDHi增强奥拉帕利的抗肿瘤疗效，降低p-RPA2、Ki67和RPA1-K167la染色强度并增加γ-H2AX染色强度。

肽段抑制RPA1 K167乳酸化增强化疗敏感性

研究人员基于RPA1 K167位点周围序列合成了六个与CPP融合的短肽。其中K167-pe（K167-peptide-6#）对RPA1乳酸化表现出最强抑制效应。以精氨酸替换K167的对照肽K167R-pe无抑制效应。K167-pe以剂量依赖方式抑制RPA1乳酸化，并抑制HR修复，增加乳腺癌细胞系对化疗药物的敏感性。在PDX模型中，K167-pe显著增加肿瘤对奥拉帕利的敏感性。

五、讨论与结论

本研究发现RPA1在K167位点发生乳酸化，KAT8为催化酶，ATM在S392位点磷酸化KAT8是该修饰所必需。RPA1 K167乳酸化增强其染色质装载和DNA结合能力，促进HR修复并导致癌细胞化疗耐药。RPA1-K167R突变体、LDH抑制剂或KAT8抑制剂处理降低RPA1乳酸化并使癌细胞对化疗敏感。K167-pe可选择性阻断RPA1乳酸化并在体外和PDX模型中使肿瘤对化疗敏感。该研究揭示了ATM-KAT8-RPA1信号轴，扩展了KAT8在DDR中的功能图景，表明KAT8介导的乳酸化可作为DNA修复的直接调控机制。靶向RPA1乳酸化而非全局抑制RPA功能，可能是克服HR功能健全肿瘤化疗耐药的可行的治疗策略。研究局限性包括：磷酸化KAT8与RPA1相互作用的结构基础尚待确定；该策略的治疗效果和安全性需要在更多临床前模型和肿瘤类型中进一步评估。