《Insects》：Gut Microbiota Restructuring and Elizabethkingia Enrichment in Aedes albopictus Larvae Under Pyriproxyfen Exposure
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白纹伊蚊（*Aedes albopictus*）传播登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒，其分布范围持续扩大，加之广泛的杀虫剂抗性，对化学媒介控制的可持续性构成威胁。吡丙醚（Pyriproxyfen, PPF）是一种用于蚊虫控制的昆虫生长调节剂，但肠道细菌与幼虫对PP
白纹伊蚊（*Aedes albopictus*）传播登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒，其分布范围持续扩大，加之广泛的杀虫剂抗性，对化学媒介控制的可持续性构成威胁。吡丙醚（Pyriproxyfen, PPF）是一种用于蚊虫控制的昆虫生长调节剂，但肠道细菌与幼虫对PPF反应之间的关系仍缺乏充分认识。研究人员将16S rRNA基因扩增子测序（16S rRNA gene amplicon sequencing）与依赖培养的分离方法（culture-dependent isolation）相结合，表征急性PPF暴露后白纹伊蚊的肠道细菌群落，并筛选可供功能研究的候选菌株。福州种群24小时半数致死浓度（median lethal concentration, LC50）为10.27 mg/L。研究人员比较了在2× LC50浓度下死亡、在5× LC50浓度下存活以及仅接受溶剂处理的福州幼虫的群落谱；经溶剂处理的佛山实验室幼虫作为外部种群参考。两种暴露组福州幼虫的细菌丰富度（bacterial richness）和香农多样性（Shannon diversity）均低于福州溶剂处理对照组，四组间的群落结构存在差异（PERMANOVA，R2 = 0.797，p = 0.001）。伊丽莎白金菌属（*Elizabethkingia*）在存活幼虫中占细菌读长的35.0%，而在死亡幼虫中占22.8%，在福州溶剂处理对照组中占7.6%，其在存活幼虫中的相对丰度显著高于另外两个比较组。从存活幼虫中通过依赖培养的分离方法获得29株分离菌株，隶属于9个属，其中3株经16S rRNA基因测序鉴定为按蚊伊丽莎白金菌（*Elizabethkingia anophelis*）。测序与培养证据的一致性，以及活性菌株的获得，使伊丽莎白金菌属成为研究这一问题的可行切入点，为探讨是否可以通过管理幼虫微生物群来维持基于吡丙醚的控制策略在其他类别杀虫剂抗性蔓延背景下的有效性开辟了途径。
**白纹伊蚊幼虫暴露于吡丙醚后的肠道菌群变化：研究背景、方法、结果与意义**
**一、研究背景与科学问题**
白纹伊蚊（*Aedes albopictus*）作为入侵性蚊虫媒介，其地理分布持续扩大，显著加剧了蚊媒传染病的防控难度。化学防治仍是媒介管理的重要手段，但常规杀虫剂抗性的广泛出现削弱了其效果，因此需要关注具有不同作用机制的化合物。吡丙醚（pyriproxyfen, PPF）是一种保幼激素类似物，作为昆虫生长调节剂，通过干扰幼期发育和成虫羽化发挥作用，而非传统杀虫剂的神经毒性机制。尽管作用机制不同，但已有研究显示按蚊（*Anopheles gambiae*）与拟除虫菊酯抗性相关的P450酶可代谢吡丙醚，中国白纹伊蚊种群中也观察到溴氰菊酯抗性与吡丙醚敏感性降低之间的关联。然而，肠道细菌组成是否与幼虫对吡丙醚的反应相关，目前尚不清楚。
在其他昆虫中，肠道细菌可通过降解作用修饰杀虫剂敏感性，从而参与宿主保护。蚊虫肠道细菌也影响幼虫发育，且群落组成与杀虫剂反应表型存在关联。但幼虫肠道群落受水生环境影响，化学暴露可改变微生物群和宿主适合度，短期吡丙醚暴露还与幼虫中肠损伤和行为改变相关。因此，暴露后的细菌谱既可能反映微生物对暴露的响应，也可能包含宿主损伤后的继发变化。此外，急性幼虫死亡与通常用于评估昆虫生长调节剂的成虫羽化终点不同。基于上述背景，研究人员提出如下问题：幼虫肠道微生物群是否以及如何随吡丙醚暴露结局而变化，哪些可培养细菌可用于功能后续研究。
**二、研究内容与主要技术方法**
研究人员以福州野外种群和佛山实验室敏感品系的白纹伊蚊为对象，通过24小时急性毒性生物测定确定吡丙醚对福州种群的半数致死浓度（LC50），并据此设置2× LC50和5× LC50两个暴露浓度，分别获取死亡幼虫（FZ-DL）和存活幼虫（FZ-SL），同时设置福州溶剂处理对照（FZ-CL）和佛山溶剂处理对照（FS-CL）。主要技术方法包括：采用16S rRNA基因V3–V4区扩增子测序对四组幼虫肠道细菌群落进行组成分析，通过QIIME2流程进行生物信息学处理，使用DADA2生成扩增子序列变体（ASV），计算Chao1、ACE、Shannon和Simpson等α多样性指数，基于Bray–Curtis距离进行β多样性分析，并运用LEfSe和Metastats鉴定差异丰度分类群；同时利用PICRUSt2和BugBase预测群落功能谱。此外，从5× LC50存活幼虫肠道中通过五种培养基（LB、NA、BHI、SS、MRS）进行依赖培养的细菌分离，并通过16S rRNA基因测序鉴定分离菌株。
**三、研究结果**
**3.1 吡丙醚对福州种群白纹伊蚊幼虫的毒性**
福州种群幼虫死亡率随吡丙醚浓度升高而增加，溶剂处理对照各重复均无死亡。概率分析估计24小时LC50为10.27 mg/L（95%置信区间：9.403–11.202 mg/L），回归方程为Probit (Y) = ?4.321 + 4.271 × log10(浓度)。基于该估计值，20.54 mg/L（2× LC50）和51.35 mg/L（5× LC50）被用作后续暴露实验的浓度。皮尔逊拟合优度检验未检出拟合不良（χ2 = 9.024，df = 13，p = 0.771）。
**3.2 测序输出与测序深度验证**
对四组共20个 pooled 肠道样本进行16S rRNA基因V3–V4区测序，共获得1,734,238条原始读长和1,294,118条非嵌合读长。观察到的ASV稀释曲线接近饱和，香农多样性曲线在各组中达到平台期，表明测序深度足以覆盖主要可检测的群落组分。
**3.3 肠道细菌群落的α多样性和β多样性**
四组间所有四个α多样性指数均存在显著差异（单因素方差分析：ACE F?,?? = 6.797，p = 0.0036；Chao1 F?,?? = 6.870，p = 0.0035；Shannon F?,?? = 10.569，p = 0.0004；Simpson F?,?? = 12.484，p = 0.0002）。两两比较显示FZ-CL的ACE、Chao1和Shannon指数高于其他各组，FZ-SL的Simpson指数与FZ-DL差异显著（校正p = 0.0019）。β多样性分析中，PCoA的PC1和PC2分别解释总变异的71.05%和9.06%，两个溶剂处理对照组沿PC1与两个吡丙醚暴露组分离，FZ-DL和FZ-SL在PC2上部分分离。PERMANOVA确认四组间群落结构差异显著（R2 = 0.797，p = 0.001）。
**3.4 肠道微生物群落的分类组成**
在门水平上，假单胞菌门（Pseudomonadota）是所有福州来源组中最丰富的门，在FZ-DL中占74.0%，FZ-SL中占63.5%，FZ-CL中占52.6%，而FS-CL中仅占35.7%。放线菌门（Actinomycetota）呈现相反模式，在FZ-DL和FZ-SL中分别仅占0.5%和1.1%，在FZ-CL中占28.4%，在FS-CL中占55.8%。拟杆菌门（Bacteroidota）在两个吡丙醚暴露组中更丰富，在FZ-SL中达35.3%。在属水平上，与FZ-CL相比，FZ-DL和FZ-SL中冷杆菌属（*Cryobacterium*）、根瘤菌属（*Rhizobium*）和丛毛单胞菌属（*Comamonas*）显著减少，而肠杆菌属（*Enterobacter*）、气单胞菌属（*Aeromonas*）和伊丽莎白金菌属（*Elizabethkingia*）显著增加。伊丽莎白金菌属相对丰度从FZ-CL的7.6%增至FZ-DL的22.8%和FZ-SL的35.0%。
**3.5 LEfSe分析鉴定的差异丰度分类群**
LEfSe分析显示，伊丽莎白金菌属及其在拟杆菌门中的更高分类等级共同表征FZ-SL，此外还包括代尔夫特菌属（*Delftia*）、草螺菌属（*Herbaspirillum*）和undibacterium属。FZ-DL由肠杆菌属、气单胞菌属和假单胞菌属（*Pseudomonas*）等多个分类群表征。FS-CL相关分类群包括冷杆菌属、节杆菌属（*Arthrobacter*）、微杆菌属（*Microbacterium*）和亮杆菌属（*Leucobacter*），而FZ-CL相关分类群涵盖丛毛单胞菌属、沃尔巴克氏体属（*Wolbachia*）、金黄杆菌属（*Chryseobacterium*）和波氏菌属（*Bosea*）等多个谱系。
**3.6 属水平相对丰度的两两比较**
FZ-DL与FZ-SL比较中，伊丽莎白金菌属和沃尔巴克氏体属在FZ-SL中显著更高，低丰度属Roseateles和Ramlibacter也显著富集于FZ-SL。FZ-DL与FZ-CL比较中，肠杆菌属、伊丽莎白金菌属和气单胞菌属在FZ-DL中显著更高，而沃尔巴克氏体属、根瘤菌属、冷杆菌属、丛毛单胞菌属、金黄杆菌属和波氏菌属在FZ-CL中显著更高。FZ-SL与FZ-CL比较中，肠杆菌属和伊丽莎白金菌属在FZ-SL中显著更高，FZ-SL与FZ-CL之间的伊丽莎白金菌属差异大于FZ-DL与FZ-CL之间的差异。
**3.7 幼虫肠道细菌群落的预测功能谱**
PICRUSt2预测显示四组共享相同的优势KEGG功能类别，其中碳水化合物代谢和氨基酸代谢在各组中占最大预测比例。两个吡丙醚暴露组中信号转导和能量代谢的预测比例高于两个溶剂处理对照组。BugBase表型预测在四组间所有检测表型（胁迫耐受、潜在致病性、革兰氏阳性、革兰氏阴性、生物膜形成、兼性厌氧、可移动元件存在和需氧表型）均存在显著差异，胁迫耐受、生物膜形成和含可移动元件的细菌预测比例在FZ-DL和FZ-SL中高于对照组。
**3.8 从吡丙醚暴露存活幼虫（FZ-SL）中分离的可培养肠道细菌**
从FZ-SL幼虫肠道中分离获得29株细菌，经16S rRNA基因测序鉴定为11个种或种级分类单元，隶属于9个属、7个科、7个目和4个门（假单胞菌门、放线菌门、拟杆菌门和厚壁菌门（Bacillota））。肠杆菌属为最常分离的属（11/29，37.9%），其次为亮杆菌属（4/29，13.8%），伊丽莎白金菌属和气单胞菌属各3株（各占10.3%）。其中3株伊丽莎白金菌属分离株经鉴定为按蚊伊丽莎白金菌（*Elizabethkingia anophelis*），GenBank登录号为PX498525–PX498553。
**四、讨论与结论**
测序和依赖培养的分离方法共同将伊丽莎白金菌属确定为吡丙醚暴露白纹伊蚊幼虫中值得功能研究的候选菌属。其在FZ-SL中的平均相对丰度高于FZ-DL和FZ-CL，并从存活幼虫中回收了3株按蚊伊丽莎白金菌分离株。由于存活和死亡幼虫接受了不同浓度的吡丙醚，观察到的差异不能将生存相关效应与剂量相关效应分离。群落差异可能源于宿主编码的解毒作用、免疫激活或微生物对吡丙醚的直接转化等多种非互斥途径。伊丽莎白金菌属是蚊虫相关菌属，按蚊伊丽莎白金菌最早分离自冈比亚按蚊中肠，其确切功能作用尚不清楚。本研究仅建立相关性，不能证明这些细菌具有保护功能或降解吡丙醚的能力。丙酮溶剂可能存在独立效应，且缺乏无溶剂对照。急性高剂量暴露条件与田间慢性低剂量暴露存在差异。未来需通过剂量匹配暴露、绝对定量、控制再定植和化学测定等实验验证候选菌株的功能。结论指出，肠道菌群谱分析和依赖培养的分离方法鉴定出伊丽莎白金菌属为吡丙醚暴露后存活白纹伊蚊幼虫中富集的分类群，其在FZ-CL中平均相对丰度为7.6%，在2× LC50死亡幼虫中为22.8%，在5× LC50存活幼虫中为35.0%，并获得了3株按蚊伊丽莎白金菌分离株。这些发现提供了可培养的菌株文库和谱分析加分离的研究框架，但数据仍属相关性，伊丽莎白金菌属或其他肠道细菌在吡丙醚敏感性中的功能作用尚未得到证实，需后续实验检验。
