《Insects》：Functional Characterization of a Galectin Gene NlGalectin-8 Involved in Development and Antifungal Immunity in the Rice Pest Nilaparvata lugens
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半乳糖凝集素（galectins）是一类进化上保守的碳水化合物结合蛋白，参与病原防御，因此在基于昆虫病原体的害虫防治中具有应用前景。然而，褐飞虱（Nilaparvata lugens，BPH）——一种极具破坏性的水稻害虫——其半乳糖凝集素的免疫学功能及生物防治
半乳糖凝集素（galectins）是一类进化上保守的碳水化合物结合蛋白，参与病原防御，因此在基于昆虫病原体的害虫防治中具有应用前景。然而，褐飞虱（Nilaparvata lugens，BPH）——一种极具破坏性的水稻害虫——其半乳糖凝集素的免疫学功能及生物防治潜力仍知之甚少。本研究在褐飞虱中鉴定并功能表征了一个半乳糖凝集素编码基因NlGalectin-8。该基因在供试的所有发育阶段和组织中普遍表达，其中在卵期和低龄若虫阶段以及血淋巴（hemolymph）和脂肪体（fat body）组织中表达量相对较高。昆虫病原真菌（entomopathogenic fungus，EPF）金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）侵染可强烈诱导NlGalectin-8的表达。通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）介导的NlGalectin-8沉默显著降低了成虫存活率和繁殖力。NlGalectin-8的下调还显著增强了褐飞虱对EPF侵染的敏感性，这可能归因于抗真菌免疫的减弱和细菌共生菌丰度的改变。本研究结果推进了对褐飞虱抗真菌免疫机制的理解，并为开发基于EPF的褐飞虱防控策略提供了见解。
褐飞虱（Nilaparvata lugens，BPH）是东亚和东南亚地区极具破坏性的水稻害虫，通过直接取食和传播病毒造成重大产量损失。化学农药虽被广泛用于褐飞虱防控，但对环境和人类健康构成显著风险。昆虫病原真菌（entomopathogenic fungi，EPF）因其广谱毒力和易于规模化生产，提供了环境兼容的替代方案，但其防效仍受限于对EPF与昆虫宿主间复杂互作的认知不足。
昆虫进化出包括体液免疫和细胞免疫应答在内的强大先天免疫系统以抵御EPF感染。昆虫通常通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRs）识别真菌病原体来源的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）来触发抗真菌免疫。半乳糖凝集素（galectins）是一类进化上保守的半乳糖苷结合凝集素，具有特征性的碳水化合物识别结构域（carbohydrate-recognition domains，CRDs），已被证实在宿主免疫调节、病原防御和微生物稳态维持中发挥重要作用。尽管已有研究报道半乳糖凝集素参与调控褐飞虱的杀虫剂抗性，但其在宿主发育和免疫调节中的功能仍不明确。
研究人员在褐飞虱中鉴定并功能表征了一个半乳糖凝集素编码基因NlGalectin-8。该基因的开放阅读框（open reading frame，ORF）全长1206 bp，编码含401个氨基酸的蛋白质，预测分子量为45.62 kD，等电点为6.38。该蛋白预测含有两个CRD结构域：N端的GLECT结构域（CRD1，第87–221位残基）含HFNPR和WGIEE两个保守基序，以及C端的Gal-bind_lectin结构域（CRD2，第266–400位残基），且未预测到信号肽。系统发育分析显示NlGalectin-8与半翅目其他昆虫的半乳糖凝集素具有较近的进化关系。表达谱分析表明，NlGalectin-8在卵期和低龄若虫期（一至三龄）表达量相对较高，在血淋巴、脂肪体和肠道中表达水平较高，且雌雄成虫间无显著差异。经金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）ARSEF456（Ma456）分生孢子悬液喷雾处理后，NlGalectin-8的表达在2天和3天时分别上调1.3倍和1.0倍。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）介导的NlGalectin-8沉默显著降低了褐飞虱成虫存活率和繁殖力。注射dsNlGalectin-8后3天，NlGalectin-8表达量较dsGFP对照组下降78.9%；注射后8天存活率仅为68.3%，而对照组为85.8%。雌成虫产卵量减少40.4%，卵孵化率降低43.7%。卵巢解剖显示沉默组雌虫卵巢发育相对较小，且卵黄原蛋白（vitellogenin，Vg）和卵黄原蛋白受体（vitellogenin receptor，VgR）的表达水平显著下降。在EPF侵染试验中，NlGalectin-8沉默显著增加了褐飞虱成虫对Ma456侵染的敏感性：第6天存活率仅为17.1%，而对照组为43.6%；LT50值从对照的5.4天（95%置信区间5.0–5.8天）降至3.1天（95%置信区间2.5–3.8天），降幅达41.8%。沉默组成虫血淋巴中真菌菌丝体丰度显著增加。免疫相关基因表达分析显示，沉默组中12个受检免疫基因中有8个表达显著受抑，其中NlToll1、NlRelish、NldefA和NllugA分别下调50.4%、52.1%、55.9%和34.9%；酚氧化酶（phenoloxidase，PO）活性也显著降低。此外，NlGalectin-8沉默显著促进了褐飞虱体内细菌总丰度（上调1.1倍），而酵母样共生菌（yeast-like symbionts，YLS）丰度无显著变化。
研究人员在开展研究时主要采用了以下关键技术方法：褐飞虱（Nilaparvata lugens）实验种群在人工气候培养箱中饲养，以秀水314水稻幼苗饲喂；EPF菌株金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）ARSEF456（Ma456）在PDA培养基上培养并制备分生孢子悬液。基因克隆与序列分析采用PCR扩增、BLAST同源性比对、SMART和InterProScan结构域预测、SignalP信号肽预测及MEGA X邻接法系统发育树构建。时空表达和EPF诱导表达分析采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR），以18S rRNA为内参，采用2?ΔΔCt法分析。RNAi实验采用体外合成的dsRNA（dsNlGalectin-8，423 bp）显微注射新羽化成虫，以dsGFP为对照。存活率和繁殖力检测采用Kaplan–Meier生存分析和卵孵化统计；卵巢形态观察采用体视显微镜；真菌负荷和微生物丰度检测采用qPCR定量分析；免疫相关基因表达检测采用qRT-PCR；PO活性测定采用L-多巴胺底物法在490 nm处读取吸光度。
讨论部分指出，NlGalectin-8是双CRD半乳糖凝集素，其N端CRD含有HFNPR和WGIEE两个保守基序，与斜纹夜蛾（Spodoptera litura）中双CRD型Slgalectins的结构特征相似。NlGalectin-8缺乏信号肽，提示其分泌不依赖经典蛋白分泌途径，可能通过质膜直接转位实现胞外释放。时空表达特征和RNAi表型共同表明NlGalectin-8在褐飞虱发育和繁殖中发挥重要作用。沉默NlGalectin-8后产卵量和孵化率显著下降，可能与卵巢发育延迟及NlVg和NlVgR表达受抑有关。NlGalectin-8在血淋巴和脂肪体中高表达，这两个组织是昆虫主要的免疫应答组织，结合EPF侵染诱导其表达上调，提示其可能作为PRR样分子参与抗真菌免疫。沉默NlGalectin-8显著增强褐飞虱对EPF侵染的敏感性并提高血淋巴中真菌负荷，表明RNAi介导的免疫基因抑制可增强EPF的杀虫效果。沉默后AMP基因表达下调和PO活性降低，说明NlGalectin-8通过调节免疫信号通路和PO系统参与抗真菌防御。此外，NlGalectin-8沉默导致细菌丰度显著增加，提示该基因对维持微生物稳态至关重要，Toll和IMD通路相关基因表达下调可能与此有关。细菌共生菌对褐飞虱生长发育和环境适应性至关重要，其丰度改变可能是沉默后褐飞虱对EPF敏感性增强的促成因素之一。
研究结论：研究结果揭示了NlGalectin-8参与调控宿主发育和抗真菌免疫。RNAi介导的NlGalectin-8沉默显著损害了宿主存活率和繁殖力，并增强了宿主对EPF侵染的易感性。这些发现表明NlGalectin-8是研究针对褐飞虱的RNAi-EPF联合防控策略的潜在分子靶标。
