HelixWings 实现了基于人工智能的酶工程技术，用于模拟生物体内的辅因子利用机制

《iScience》：HelixWings enables AI-driven enzyme engineering for biomimetic cofactor utilization

　　亮点：
- HelixWings结合了人工智能（AI）和理性设计用于酶工程
- 一个网络服务器可以方便地访问HelixWings平台
- HelixWings提高了酶对仿生烟酰胺辅因子的利用效率
- 工程化的P450显示出增强的NMNH支持的电子转移能力

摘要：
仿生烟酰胺辅因子（如烟酰胺单核苷酸NMNH）与天然辅因子（如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH）相比，可以大大降低合成成本。然而，天然酶使用这些替代辅因子时的活性通常较差。现有的工程方法，包括定向进化和理性设计，仍受到实验不确定性和计算复杂性的限制。在这里，我们开发了HelixWings，这是一个由AI驱动的筛选平台，它将构象动力学分析与静态微环境分析相结合，以识别与仿生辅因子兼容的酶变体。应用于广泛用于手性合成和药物前体生产的P450BM3时，HelixWings发现该变体在NMNH支持条件下的催化效率提高了404%。该平台还通过CYP116B46得到了进一步验证，其NMNH利用效率提高了217%。与理性设计相比，HelixWings将筛选时间减少了23倍。

引言：
酶催化的主要优势在于它能够高效地实现许多有机合成难以实现的反应，并且对环境的影响较小。其中，由氧化还原酶介导的位点选择性和立体选择性化学合成应用最为广泛。这些酶通常依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）（NAD(P)+，这种辅因子的供应有限且再生效率低下，从而增加了生产成本。仿生烟酰胺辅因子保留了天然氧化还原辅因子的催化基团，但具有更简单、更容易合成的结构，在成本、稳定性和电子转移动力学方面具有优势。例如，烟酰胺单核苷酸（NMNH）与天然辅因子具有结构相似性，可以从低成本的前体中可再生生产，并能高效、稳定地促进工业相关的电子转移。然而，大多数野生型（WT）酶要么无法有效利用NMNH，要么使用这些辅因子时的活性很低。因此，通过工程改造酶使其偏好从天然辅因子转变为高效的仿生烟酰胺类似物，可以显著降低体外合成生物学的生产成本。

定向进化是酶工程中常用的策略，以实现仿生烟酰胺辅因子的有效利用。Huang等人应用位点饱和突变法改造了6-磷酸葡萄糖脱氢酶（6PGDH），使其在NMN+上的催化效率比WT提高了50倍。然而，这种方法需要构建庞大的突变库并进行大量的实验工作。而基于计算模拟的理性设计则提供了更有效的途径来确定有利突变。Black等人证明，通过改造葡萄糖脱氢酶（GDH）的AMP结合口袋，其NMNH识别能力提高了107倍。从而能够将NMN依赖的GDH突变体与多种氧化还原酶在体外有效耦合，创建出在生物正交系统中利用NMNH的工程化酶。另外，King建立了基于生长的筛选平台，分离出在NMNH作用下催化效率提高10倍的Lactobacillus pentosus NADH氧化酶变体，并提出优化结合天然辅因子时的整体构象动力学是接受仿生烟酰胺辅因子的优选策略。值得注意的是，Liu等人通过对NMNH和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）之间的距离施加约束来筛选可行的突变体，成功获得了能够利用NMNH的酶变体，并认为仿生烟酰胺辅因子与黄素辅因子之间的距离是成功重新设计的关键决定因素。尽管理性设计提出了有效利用仿生烟酰胺辅因子的明确设计原则，但该领域仍缺乏一种可以定量整合辅因子定位、构象适应性和电子转移需求的流程导向策略，难以同时实现工程精度和设计效率。因此，通过定量建模这些耦合因素来实现精确高效的酶重新设计仍然是一项未解决的挑战。

近年来，人工智能（AI）的进步显著加速了蛋白质科学的进展。Li等人引入了可解释的卷积神经网络分子动力学（ICNNMD）模型，这是一种用于分子动力学（MD）轨迹分析的可解释深度学习框架，可以从MD模拟生成的庞大构象空间中识别功能状态和关键残基。ICNNMD为评估突变酶中仿生烟酰胺辅因子与黄素辅因子之间的构象关系提供了高效的计算工具。因此，我们重点研究了氧化还原酶P450，旨在探索如何结合AI模型和理性设计来实现仿生烟酰胺辅因子的有效利用。

自给自足的细胞色素P450酶主要分为两类，每种类型具有不同的结构和功能特征（图S1）。第一类以Bacillus megaterium CYP102A1（P450BM3）为代表，包含血红素结构域和细胞色素P450还原酶（CPR）结构域。电子传递路径为：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）→ FAD → FMN → 血红素。第二类以CYP116为代表，包含血红素结构域和邻苯二甲酸二氧酶型还原酶（PDR）结构域。在此系统中，电子传递路径为：NAD(P)H → FMN → [2Fe–2S] → 血红素。因此，我们的目标是研究如何在还原酶结构域中用NMNH替代NADPH后，确保酶变体仍保持高活性和催化效率。

本文提出了一种计算策略，将设计目标转化为操作步骤。通过将AI模型与微环境中的氨基酸相互作用分析技术整合到一个统一的操作平台上，可以快速识别调节仿生辅因子与酶相互作用的关键氨基酸，从而在酶工程中实现高命中率。当应用于P450BM3和CYP116B46这两种酶时，其催化效率分别比WT对应物提高了404%和217%。因此，成功获得了能够高效利用仿生烟酰胺辅因子NMNH的高活性变体。

酶-辅酶相互作用分析：
我们将仿生烟酰胺辅因子NMNH与天然辅因子NADPH进行了比较。值得注意的是，另一天然辅因子NADH在结构上也与之平行（图1A）。NMNH是天然烟酰胺辅因子的截短类似物，主要修改发生在AMP部分，仅保留了参与氢转移的烟酰胺环结构。先前对WT P450酶CPR结构的机制分析表明，FAD从NADPH接受电子（图1B），说明快速的内部电子转移需要较短的供体-受体距离。此外，NADPH的电子转移会引起显著的构象变化，NADPH结合态和未结合态的构象不同。然而，现有的晶体结构仅解析了Bacillus megaterium P450BM3的NADP+结合态和自由态，未能捕捉到NADPH结合时的构象变化。为了有效设计利用NMNH的高活性变体，我们提出重建WT酶与NADPH结合的复杂构象以分析其作用机制。具体来说，使用同源结构1J9Z的结构信息补充了4DQL中的不完整NADPH构象（图S2，均方根偏差[RMSD] = 1.127），然后对该模型进行MD采样以放松重构的辅因子环境。在NADPH未结合状态下，Trp1047侧链阻挡了FAD的异唑环与NADPH的接触，需要重新排列残基以实现NADPH依赖的FAD还原（图1C）。这与豌豆铁氧还蛋白-NADPH还原酶中的观察结果一致，其中烟酰胺环导致同源残基Tyr308的位移。虽然AlphaFold3用于建模P450BM3-NADPH复合物，但蛋白质结构预测的RMSD与晶体结构相比为1.401，表明配体定位和构象状态与晶体状态不符（图S2–S4），突显了模型在捕捉辅因子诱导的别构效应方面的局限性。最终，我们选择了一个动力学采样的复杂模型，并进一步将NADPH的AMP部分替换为NMNH，建立了包含NMNH的WT P450BM3的复杂模型。

图1 结构比较
（A）NADPH、NADH和NMNH的分子结构比较
（B）NADPH向FAD的电子转移过程：NADPH失去电子形成NADP+，而FAD获得电子形成FADH2
（C）P450BM3蛋白质结合和未结合NADPH时的堆叠情况，突出显示了W1047残基的位移
（D）FAD和NADPH结合口袋的相互作用环境
（E）WT复合物和S848R变体中FAD-N5与NMNH-C4H之间的距离
（F）S848R的量子力学（QM）计算氢转移能垒

在成功重构辅因子结合模型后，我们观察到NADPH的C4氢原子与FAD的N5原子之间的距离非常接近，促进了直接电子转移。同时，结合口袋形成了一个功能关键的网络相互作用，Ser831、Thr846和Cys1000通过氢键和其他非共价相互作用包围了异唑环。这种排列与NADP(H)结合和调节电子从NADPH转移到辅酶FAD所必需的“催化三联体”残基一致。此外，涉及NADPH部分的关键相互作用还包括Thr846和Ser848与磷酸基团的氢键、Trp1047与烟酰胺基团的氢键以及Asp943与AMP基团的氢键。这种相互作用模式构成了WT酶依赖NADPH的基本机制（图1D和S5）。相比之下，分析P450BM3与NMNH结合的复合物揭示了一个关键限制：根据已建立的蛋白质电子转移文献和一般的距离依赖性电子转移考虑，FAD-N5与NMNH-C4H之间的5.2 ?距离不利于电子转移。结合仿生烟酰胺辅因子在天然酶系统中通常较低的氧化还原兼容性，这可能解释了WT酶使用NMNH时活性较低的原因。在先前报道的利用NMNH的变体中，S848R是一个代表性的基准突变体，因为它已经显示出对NMNH的活性改善。因此，我们首先从结构层面分析了这一突变体，以了解局部静电和几何变化如何促进有效的辅因子定位。S848R变体将FAD-N5与NMNH-C4H之间的距离显著缩短至4.0 ?（图1E）。尽管该距离比NADPH → FAD路径中的距离长，但量子力学计算确认这种配置保持了相同的能量障碍8.3 kcal/mol（图1F），从而实现了仿生烟酰胺辅因子对酶活性的有效利用。此外，对S848R-NMNH复合物的分析表明，极性氨基酸的突变可以改变活性位点周围的整体环境（图S6和S7）。

因此，我们提出利用仿生烟酰胺辅因子的有效酶工程策略应关注两个关键因素。首先，仿生辅因子必须通过建立辅因子与周围残基之间的相互作用网络来复制天然辅因子的电子转移模式，从而调节结合环境。其次，通过有针对性的几何限制应用构象约束，可以优化烟酰胺基团与黄素异唑环之间的电子转移距离。然而，将这些因素量化为可计算的过程导向工作流程仍是我们研究的主要焦点。

HelixWings设计平台的计算工作流程：
为了实现我们的设计原则，我们开发了HelixWings设计平台（图2）。该策略包括四个关键步骤：
（1）使用深度学习模型识别显著影响未结合态和配体结合态之间构象变化的氨基酸残基；对这些残基进行排名并选择前10个，特别关注远离局部辅因子相互作用区域的残基，而不仅仅是直接接触NMNH或FAD的残基，以避免蛋白质适应性景观中常见的局部最优解陷阱。
（2）通过以4 ?分辨率筛选核心层中的氨基酸来聚焦辅因子，指导理性设计以适应活性位的微环境。
（3）对步骤1和2中选出的关键残基进行结构导向分析，优先考虑两个步骤共有的氨基酸，然后是AI模型预测的氨基酸，以确定影响辅因子亲和力变化的主要残基。
（4）对排名靠前的残基集进行饱和突变，通过受限MD模拟调节仿生烟酰胺辅因子的结合构象，分析能量变化排名。在本工作流程中，ΔΔG排名作为机械指导筛选策略中的优先工具，而不是选择突变体和实验验证突变序列的唯一标准。推荐的最终突变酶数量是灵活的，应在实验成本和发现额外有益突变的可能性之间取得平衡。值得注意的是，S848R和W1047S之前已被确定为有助于提高P450BM3中NMNH支持的活性的有益突变。我们首先将这些突变结合起来进行了动态验证，意外地发现双突变体（S848R/W1047S）的活性比野生型（WT）提高了3.2倍。因此，我们选择S848R/W1047S作为计算设计的起点。

图2 HelixWings设计平台
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(A) 进行分子动力学模拟以获得轨迹。
(B) 进行ICNNMD计算以识别对构象变化有显著贡献的氨基酸残基。
(C) 识别在P450BM3中发生构象变化的影响显著氨基酸。
(D) 分析结合口袋内的相互作用。
(E) 选择同时参与构象变化和相互作用的TOP氨基酸。
(F) 应用特定的构象限制。
(G) 在这些构象限制下通过对TOP氨基酸进行饱和突变来计算能量变化。

我们对S848R/W1047S变体在结合和未结合状态下进行了三次平行的100纳秒分子动力学（MD）模拟（图2A）。按照所提出的程序，得到的MD轨迹被用作ICNNMD分析框架模型的输入数据（图2B）。该模型利用深度学习技术直接识别与不同蛋白质构象状态相关的关键残基。使用该模型，我们识别了在NMNH结合时参与构象变化的核心残基。模型预测了前十个关键氨基酸热点（图2C）。随后，分析了NMNH包含的复合结构的最低能量构象中的氨基酸相互作用，列出了与NMNH和FAD都相互作用的氨基酸。基于之前对S848R的相互作用分析，只选择了极性氨基酸（图2D）。ICNNMD模型能够快速识别与NMNH诱导的构象变化相关的残基。通过结合远端突变，它避免了局部最优解。通过相互作用分析，还可以准确识别口袋微环境中的合理设计。通过对这些步骤中选定的氨基酸进行饱和突变，可以进行实验筛选。然而，由于选定的残基数较多，实验测试成本较高。因此，我们对ICNNMD残基和相互作用分析进行了交叉分析，确定R680和T906为“顶级热点”残基（图2E）。此外，为了关注远端突变的效果，从模型预测排名中选择了前三名氨基酸作为补充的热点残基（表S1）。值得注意的是，将相同的方案应用于WT和WT-NMNH复合体时，发现之前报道的位置W1047和S848都被归类为顶级热点残基，验证了我们策略识别显著影响结合特性的残基的能力。最后，我们对顶级热点残基进行了饱和突变，计算了能量差异（图2F和2G），生成了一个排名突变体库，并测量了活性和动力学参数。

基于突变的ΔΔG值，我们对库中的变体进行了排序和表征，并对前20个变体进行了实验验证（图3A）。需要注意的是，ΔΔG排名在这里主要作为突变选择的结构指导性指标。因为计算出的结合能变化主要反映了模型化构象状态内的相互作用稳定性，而Kcat/KM受到辅因子结合、构象动力学和催化转化率的共同影响，因此计算排名与实验动力学之间可能存在部分而非完全一致的情况。使用细胞色素c作为底物，我们量化了辅因子支持的电子转移，并发现某些变体的催化效率高于S848R/W1047S。其中，S848R/W1047S/T906A表现出最高的比活性（2.19 × 10^3 U/mg），其次是S848R/W1047S/T906S（2.01 × 10^3 U/mg，图3B）。并非所有测试的突变都能提高活性。实验筛选的变体及其相应的活性结果总结在表S2中。借鉴以往的研究，我们比较了WT、S848R、S848R/W1047S、S848R/W1047S/T906S和S848R/W1047S/T906A的动力学参数（表1）。在测试的变体中，S848R/W1047S/T906A显示出最高的Kcat/KM，比WT提高了404%。在NMNH支持的条件下，细胞色素c的表观KM较低，加上Kcat的增加，使其在测试的变体中具有最高的表观催化效率。相比之下，S848R/W1047S/T906S虽然显示出了较高的酶活性，但其Kcat/KM相比单突变体S848R仅有微小的提高，未能超过S848R/W1047S。为了进一步验证我们的变体是否能够使用NMNH进行完整的生理催化，我们使用12-para-nitrophenoxydodecanoic acid（12-pNCA）评估了P450BM3 WT和S848R/W1047S/T906A的动力学参数。如表2所示，WT P450BM3在NADPH条件下对12-pNCA表现出强烈的氧化作用，证实了预期的催化活性；然而，在NMNH条件下未检测到氧化作用。相比之下，S848R/W1047S/T906A在NMNH条件下表现出显著增强的活性，其催化效率（2.0 min^-1 μM^-1）接近于NADPH条件下的WT（2.2 min^-1 μM^-1），表明这种工程变体能够有效利用仿生辅因子。

图3 使用NMNH辅因子的具有高催化效率的变体分析
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(A) 前20个饱和突变的能量值。
(B) 对高活性变体的实验测定。每次测量重复三次。数据以均值±标准差表示。
(C) S848R/W1047S/T906A变体的能量景观。
(D) 在模拟过程中与NMNH形成氢键频率超过50%的S848R/W1047S、S848R/W1047S/T906A和S848R/W1047S/T906S变体。
(E) S848R/W1047S、S848R/W1047S/T906A和S848R/W1047S/T906S变体中FAD-N5到NMNH-C4H的距离。
(F) S848R/W1047S、S848R/W1047S/T906A和S848R/W1047S/T906S变体中FAD-N5到NMNH-C4H的距离和回转半径（Rg）。

酶
KM (μM)
Kcat (min^-1)
Kcat/KM (min^-1 μM^-1)
a
WT
23.1 ± 3.0
64.3 ± 1.8
2.8 ± 0.4
S848R
15.2 ± 3.7
87.1 ± 2.9
5.7 ± 1.4
S848R/W1047S
12.3 ± 2.2
101.1 ± 1.6
8.2 ± 1.5
S848R/W1047S/T906A
9.7 ± 2.1
109.4 ± 1.9
11.3 ± 2.5
S848R/W1047S/T906S
13.8 ± 2.2
93.3 ± 1.3
6.7 ± 1.1
表1 P450BM3变体在NMNH支持下还原细胞色素c的动力学参数
WT, S848R, S848R/W1047S, S848R/W1047S/T906A, 和 S848R/W1047S/T906A
每次测量重复三次。数据以均值±标准差表示。
a
动力学参数通过非线性回归拟合到Michaelis-Menten方程获得。KM和Kcat以最佳拟合值和95%置信区间表示；Kcat/KM是根据拟合参数计算得出的。

表2 12-pNCA在P450 WT和S848R/W1047S/T906A下的动力学参数
每次测量重复三次。数据以均值±标准差表示。
a
动力学参数通过非线性回归拟合到Michaelis-Menten方程获得。KM和Kcat以最佳拟合值和95%置信区间表示；Kcat/KM是根据拟合参数计算得出的。

为了阐明观察到的动力学变化的机制起源，我们对三种关键变体：S848R/W1047S、S848R/W1047S/T906A和S848R/W1047S/T906S在NMNH复合体中进行了100纳秒全原子MD模拟。模拟轨迹提供了这些突变如何调节对仿生烟酰胺辅因子偏好的原子级见解。自由能景观的分析显示，所有三个系统都呈现一个单一的主导能量井（图3C和S8），从中我们提取了最低能量的构象进行详细的结构分析。对氢键网络的分析揭示了变体之间的不同模式。在亲本S848R/W1047S变体中，T906与NMNH形成了最稳定的氢键，占据率为70.3%，而G905在模拟过程中的氢键占据率为59.6%。T906S突变导致S906发挥了主导的氢键作用。T906A变体表现出异常的稳定性，A906的氢键占据率高达79%，表明这种突变有效地将NMNH锁定在最佳结合位置（图3D）。值得注意的是，这一趋势与实验观察结果一致，其中S848R/W1047S/T906A在测试的变体中表现出最高的NMNH支持活性和最有利的外观动力学行为。NMNH C4N和FAD N5原子之间的距离测量确认所有变体都将这一关键的电子转移对保持在小于4 ?的有效范围内，尽管存在细微变化（图3E）。S848R/W1047S突变体显示了最短的距离，其次是T906A和T906S突变体。值得注意的是，模拟蛋白复合物的回转半径（Rg）分析表明，T906A和T906S变体比亲本S848R/W1047S变体具有更紧凑的构象分布，其中T906S的Rg最小（图3F）。这种增加的紧凑性可能有助于尽管T906S的KM值不理想，但仍观察到的活性增强。代表性构象的结构分析提供了对这些差异的机制性见解（图4）。在T906A变体中，丙氨酸替换促进了与NMNH的新氢键的形成，同时允许P904和G905在空间上重新定位辅因子，使其C4原子朝向FAD异噁唑环最佳定位。R848似乎在电静力上补偿了NMNH缺失的AMP“识别把手”，这与之前关于辅因子特异性工程的研究报告的策略一致。T906A变体因其稳定的相互作用和构象控制的独特组合而特别有效，解释了实验观察到的优越催化参数。相比之下，T906S变体虽然受益于R848的电静力贡献，但其N5-C4N距离增加，可能是其催化效率降低的原因。这些全面的模拟表明，成功工程化仿生烟酰胺辅因子的利用取决于三个关键因素：精确控制辅因子结合的构象、优化电静力和氢键网络以及保持适当的结构刚性。这些发现与之前的研究结果一致，并扩展了之前的研究，表明辅因子特异性开关需要在结合口袋内仔细平衡多个物理化学性质。

图4 蛋白质变体的结合口袋插层环境
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(A) S848R/W1047S、(B) S848R/W1047S/T906A和(C) S848R/W1047S/T906S变体的结合口袋插层环境。

为了进一步验证HelixWings平台的普遍性，我们将其应用于修改CYP116B46以优化其对仿生烟酰胺辅因子的偏好。尽管CYP116B46也作为一个自给自足的氧化还原酶发挥作用，但其电子转移过程和整体结构与P450BM3有显著不同。首先，对CYP116B46进行了建模以获得与NMNH结合的复合体。然后进行了MD模拟，并将NMNH结合和NMNH未结合状态的动力学轨迹输入ICNNMD模型，成功识别了“动态”氨基酸（图5A）。接下来，提取了稳定的构象来分析NMNH和FMN周围的相互作用环境，并筛选了极性氨基酸（图5B）。结合ICNNMD分析与微环境相关的氨基酸，最终确定了残基D534和C653。此外，ICNNMD排名前五的氨基酸——H501、S684、L485、L483和Q514——被选为修改的候选者（图5C）。对这些顶级热点氨基酸进行了饱和突变的能量计算，选出了前20个变体进行实验验证。这种方法最终确定了两种催化性能提升的变体：H501M和Q514F（图5D）。这些变体的Kcat/Km值分别比WT提高了125%和217%（表3）。此外，我们使用2-羟基苯乙酸作为底物进行了氧化测定。WT在NADPH支持下产生了明显的HGA相关信号，而在NMNH支持下未检测到相应的产物信号。相比之下，Q514F在NMNH支持下产生了可检测的HGA相关信号（图S12和S13）。在相同的液相色谱-质谱（LC-MS）采集条件下，Q514F/NMNH的HGA相关m/z 167信号低于WT/NADPH。由于未使用内标准品，这种比较旨在提供一个半定量结果，而不是绝对的产品产率测量（图S14），表明尽管突变体可以利用NMNH，但仍需要进一步优化以达到NADPH的效率。值得注意的是，这里鉴定出的有益CYP116B46突变与P450BM3案例中强调的直接第一壳层辅因子接触环境的关系不那么直接。这一观察表明，在CYP116B46中，构象调节或更广泛的结构效应可能比单纯的局部口袋重塑对改善NMNH支持的电子转移行为有更强的影响。虽然当前数据还不允许对这些远端效应进行完整的机制分析，但它们表明HelixWings可能在不同的还原酶架构中捕获功能相关的决定因素。

图5 使用NMNH的CYP116B46变体设计
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(A) ICNNMD筛选以识别高影响力氨基酸。
(B) 分析结合口袋相互作用环境。
(C) 选择TOP氨基酸。
(D) 高活性变体的实验筛选。每次测量重复三次。数据以均值±标准差的形式呈现。（E）人工智能模型加速效应的比较。
酶 KM (μM) Kcat (min?1) Kcat/KM (min?1 μM?1)
aWT 35.5 ± 2.9 0.9 ± 1.2 1.2 ± 0.1
H501M 28.5 ± 2.0 43.7 ± 1.0 1.5 ± 0.1
Q514F 21.0 ± 2.2 54.9 ± 1.7 2.6 ± 0.3

表3 CYP116B46 WT、H501M 和 Q514F 的细胞色素 c 的动力学参数
每次测量重复三次。数据以均值±标准差的形式呈现。
a动力学参数是通过非线性回归拟合米氏方程获得的。KM 和 Kcat 以95%置信区间表示；Kcat/KM 是根据拟合参数计算得出的。

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“HelixWings”平台在 CYP116B46 上的成功应用展示了将结构引导的口袋微环境设计与基于酶和辅因子之间结合机制的远程突变高效筛选相结合的计算策略的可行性。对于时间成本比较（图5E），这里使用了 CYP116B46 还原酶域模型中229个残基的穷举计算饱和突变作为上限参考，估计总时间为916小时，以展示HelixWings实现的搜索空间减少。实际上，替代的结构引导策略通常会先筛选位于辅因子附近的残基。然而，当前的工作流程不仅限于局部第一层残基，还可以优先考虑通过构象分析识别的远端候选残基。在这个框架内，基于ICNNMD的优先级排序将需要下游计算的残基数量减少到了10个，估计总时间为40小时，从而显著降低了整体计算负担。为了提高HelixWings的可访问性和可用性，我们开发了一个基于网络的界面，用于设计高效利用廉价仿生辅因子的酶变体。该网站是 http://www.lujialab.org.cn/server。

讨论
HelixWings 将人工智能辅助的动态构象分析与局部结合微环境的理性设计相结合，为酶工程提供了一种机制导向的策略。尽管数据驱动的机器学习在蛋白质设计方面取得了进展，但许多当前方法仍受限于可用实验数据集的规模和质量，并且往往更注重预测性能而非物理化学的可解释性。因此，这些方法在已知数据范围内对候选者进行排名时往往有效，但在解释特定突变为何成功或失败方面信息较少，尤其是在需要同时重新配置辅因子识别和电子转移几何结构时。相比之下，这里开发的工作流程结合了结构动力学、局部相互作用分析和突变优先级排序，从而支持了一种更加有针对性的仿生辅因子利用策略。

HelixWings 的一个核心特点是它不仅仅将辅因子工程视为一个简单的局部结合口袋替换问题。相反，工作流程首先分析天然酶如何容纳其天然辅因子，以及哪些几何和微环境特征与有效的电子转移相关。然后，根据这一机械参考模型对仿生烟酰胺辅因子的相互作用进行建模，从而将辅因子定位、局部稳定或供体-受体几何结构中的关键缺陷转化为具体的工程目标。在这种设置中，理性设计在候选空间中保留了结构和化学相关性，而人工智能辅助的构象分析则将搜索范围扩展到不仅仅是最明显的第一层残基，并帮助识别可能通过构象状态的动态重新分布间接影响催化作用的远端位置。这种组合对于辅因子工程尤为重要，因为其有效性不仅取决于配体的静态容纳，还取决于蛋白质骨架支持催化活性电子和构象安排的能力。

目前的结果表明，这种集成策略可以在两个不同的自给自足的P450系统中丰富功能相关的突变位点。重要的是，这两个系统似乎并没有通过完全相同的机制路径进行改进。在P450BM3中，有益突变更直接与第一层辅因子定位和还原酶侧辅因子识别区域的相互作用重塑相关，这与以口袋级几何优化为主的机制一致。相比之下，在CYP116B46中，有益突变与直接与第一层辅因子接触的残基的关系不那么直接，这表明构象调节或更远范围的结构效应可能在这个系统中起着更重要的作用。这种对比在机制上具有信息性，因为它意味着仿生辅因子利用的决定因素可能因还原酶架构的不同而有所不同。从这个意义上说，HelixWings 的价值不仅在于减少突变搜索负担，还在于提供了一个框架，用于识别在给定酶系统中哪种机制层面（局部相互作用重塑或远端构象控制）可能占主导地位。从更广泛的酶工程角度来看，这项研究还强调了将远端位点分析整合到辅因子重新设计中的重要性。传统的结构引导策略通常优先考虑围绕配体的残基，这是一个合理的初步步骤，但可能会错过那些通过构象耦合传递效应的突变。因此，HelixWings 中包含的人工智能优先级排序的远端残基不仅仅是一种计算便利；它反映了一个机制假设，即通过重塑辅因子识别的动态环境可以改善催化性能。同时，当前的结果也清楚地表明，人工智能预测的残基不应被解释为确定性的有益突变。相反，它们最好被视为下游机制筛选的丰富候选者。它们的价值在于增加实验测试位点具有功能信息性的概率，而不是消除实验验证的需要。因此，HelixWings 提供了一个实用且机制上可解释的框架，用于改进仿生辅因子的利用，并可能有助于未来降低成本和扩大依赖辅因子的生物催化作用的规模。

研究的局限性
HelixWings 是作为一个集成平台开发的，用于通过结合人工智能辅助的构象分析和局部微环境引导的设计来筛选使用仿生烟酰胺辅因子的酶变体。使用这一框架，我们识别出了P450BM3和CYP116B46的性能得到改善的变体。然而，应该注意到几个局限性。首先，本研究中的实验验证仅限于自给自足的P450系统，目前尚不清楚相同的定量设计原则是否可以转移到其他依赖辅因子的酶家族。其次，工作流程依赖于初始结构模型的质量、MD采样的充分性以及相关构象亚状态的覆盖范围。如果这些条件没有得到充分满足，残基优先级排序可能会变得不那么稳健。第三，当前研究中的动态残基优先级排序依赖于单一的人工智能基础构象分析框架，需要更广泛的对比其他方法来更全面地评估其稳健性。此外，底物氧化实验确实证实了工程变体的NMNH支持催化作用，但并未证明NMNH支持的催化作用普遍等同于天然NADPH支持的催化作用。因此，还需要在酶和底物系统中进行进一步的优化和更广泛的验证。

资源可用性
更多信息和资源及试剂的请求应联系主要联系人Lujia Zhang（[e-mail]）。

材料可用性
本研究没有生成新的独特试剂。

数据和代码的可用性
• 本研究生成的加工计算数据，包括基于ICNNMD的突变排名结果（表S1和S3）和最终排名结果（表S2），都包含在补充信息中。
• 手稿中报告的所有其他数据将在请求时由主要联系人提供。
• 所有原始代码已存放在 https://github.com/maxwellcheung/HelixWings.git，并在出版日期时公开可用。
• 重新分析本文报告的数据所需的任何其他信息均可向主要联系人请求获得。

致谢
资金由中国的国家重点研发计划（项目编号2024YFA0917900）、广西自然科学基金（2025GXNSFDA04240006）、上海市科学技术委员会（项目编号23HC1400500）、宁夏回族自治区重点研发计划（项目编号2024BEE02021）、中国国家自然科学基金（项目编号22208106和62474105）以及上海人工智能实验室提供。

作者贡献
概念化：C.Z.、Y.F. 和 L.Z.；数据管理：C.Z.、Y.F. 和 Y.J.；研究：C.Z.、Y.F. 和 Y.J.；方法论：C.Z.、Y.F.、Y.J.、M.R.、R.Z.、Z.Y. 和 H.S.；可视化：C.Z.、Y.F.、T.T. 和 T.M.；写作（初稿）：C.Z. 和 Y.F.；写作（审稿和编辑）：C.Z.、Y.F.、Y.J.、H.W.、B.G. 和 L.Z.；验证：M.R. 和 R.Z.；软件：Z.Y. 和 H.S.；形式分析：T.T. 和 T.M.；资源管理：B.F. 和 L.T.；项目管理：H.W.、B.G. 和 L.Z.

利益声明
作者声明没有利益冲突。

★ 方法
关键资源表

试剂或资源
来源标识符

细菌和病毒株
E.coli DH5α：WeidiCAT#: DL1001
E. coli BL21(DE3)：WeidiCAT#: EC1002

化学品、肽和重组蛋白
NMN：aladdinCAT#: N131850
细胞色素 c：sigmaaldrichCAT#: C2506
NADPH：MedMolCAT#: T2865
112-(para-nitrophenoxy)dodecanoic acid：MedMolCAT#: V677
52-hydroxyphenylacetic acid：MedMolCAT#: B270
Homogentisic acid：MedMolCAT#: B272
P450BM3变体（表S2）：N/
CYP116B46变体（表S2）：N/

关键商业试剂
质粒提取试剂盒：OmegaCAT#: D6943
钝化Kination连接试剂盒：TakaraCAT#: 6127
ABC蛋白浓度测定试剂盒：SolarbioCAT#: PC0020
快速定向突变试剂盒：TiangenCAT#: KM101
重组DNA：pET28a-P450BM3：GenScriptN/A
pET28a-CYP116B46：GenScriptN/A
pET28a-P450BM3变体（表S2）：N/A
pET28a-CYP116B46变体（表S2）：N/

软件和算法
AmberCase等人：https://ambermd.org/index.php
Gaussian 16：Frisch等人：https://gaussian.com/gaussian16/
Ligplot：Laskowski等人：https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/
Modeller：Webb等人：https://salilab.org/modeller/
ICNNMD：Li等人：https://github.com/Jane-Liu97/ICNNMD
AlphaFold 3：Abramson等人：https://alphafoldserver.com/HelixWings：https://github.com/maxwellcheung/HelixWings.git
HelixWings网站：http://www.lujialab.org.cn/server
OriginPro 9.0：OriginLab：https://www.originlab.com/

其他
蛋白质结构：Rcsb pdb：https://www.rcsb.org/AKTA Pure 25
UPLC H-CLASS-SQD：N/A

实验模型和研究参与者详情
在本研究中，使用E.coli DH5α细胞进行质粒扩增，使用E.coli BL21(DE3)进行蛋白质表达。使用Luria-Bertani（LB）培养基（10 g/L色氨酸，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl）进行细胞培养。细胞在37°C下培养12小时，然后以1%的比率接种到100毫升摇瓶中，在37°C下培养直至OD600nm达到0.6–0.8。接下来加入0.2 mM IPTG（异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷），并在20°C下诱导表达12小时。

方法细节
蛋白质结构准备
使用P450BM3与NADP+复合物中的FAD/NADPH结合域（FAD域）的晶体结构（PDB ID：4DQL）作为起始结构。然而，由于NADPH中的烟酰胺单核苷酸部分高度无序，4DQL结构缺乏该区域的精确构象信息。为了解决这个问题，我们使用了大鼠NADPH-细胞色素P450氧化还原酶（CYPOR，PDB ID：1J9Z）的晶体结构，其中包含详细的NADP+结构信息。4DQL和1J9Z的FAD域具有显著的相似性（序列一致性为49.0%）。通过将1J9Z与4DQL进行结构对齐，能够重建完整的NADPH结构，并通过去除额外的R基团部分生成NMNH。此外，本研究中的建模是在单体水平上进行的，重点关注还原酶侧区域的辅因子结合几何结构和局部电子转移相互作用。尽管据报道P450BM3采用二聚体状态，但当前工作流程中没有明确考虑二聚化。重建的复合物本身并不被视为最终的静态模型，而是作为后续分子动力学松弛和构象采样的起始配置。CYP116B46的全长晶体结构（PDB：6LAA）是可用的。还原酶域被提取出来进行进一步分析，但NADPH结合形式的结构仍然不清楚。因此，我们采用了Guo的建模方法，使用1QFZ作为参考，构建了CYP116B46还原酶域与NADPH复合物的结构模型，然后进行了分子动力学优化。

分子动力学模拟
NADPH和NMNH的部分原子电荷是使用AM1-BCC方法计算的。蛋白质和配体参数分别使用AMBER18中的ff14SB和GAFF2力场分配。系统在TIP3P水盒子中溶解，缓冲距离为10 ?，加入钠离子以保持系统中性。能量最小化分为两个阶段进行：首先，在500 kcal/(mol·?2)的力常数下优化溶剂水分子；其次，在没有约束的情况下优化整个系统。系统在300 ps内从0 K逐渐加热到300 K，期间施加了弱约束（10 kcal/(mol·?2)）。SHAKE算法约束了所有涉及氢原子的键，长程电静力相互作用使用Particle Mesh Ewald方法处理。生产MD模拟在NPT系综中进行了100 ns。

DFT计算
NMNH和FAD的密度泛函理论（DFT）计算使用Gaussian 16软件进行。过渡态计算、几何优化和频率计算在B3LYP/def2-SVP水平进行，水的溶剂效应使用SMD连续介电模型考虑。结构优化后，使用更大的def2-TZVP基组在B3LYP水平上计算了更准确的单点能量。所有量子力学（QM）计算均包括了使用Grimme的D3方法计算的色散校正。模型分析和顶级残基的选择：蛋白质轨迹被输入到ICNNMD中进行预测（ICNNMD的使用依据了先前发表的框架，相关架构和训练细节在原始方法论文中有描述），根据其得分生成了氨基酸的排名列表。同时，使用Amber进行了聚类分析，并对稳定轨迹帧中的代表性构象进行了LigPlot分析以识别关键相互作用残基。ICNNMD识别的残基与LigPlot相互作用分析确定的残基的交集被定义为TOP残基，这些残基随后接受了饱和突变计算。使用AMBER18的LEaP模块替换了氨基酸侧链以实现突变。突变后的蛋白质结构通过最陡下降法和共轭梯度法进行了优化。随后，应用分子力学/广义Born表面积（MM/GBSA）方法基于优化的突变结构计算蛋白质与底物之间的结合自由能。所有计算都在NVIDIA GeForce RTX 4090显卡和24核CPU上完成，报告的运行时间反映了在该特定配置下观察到的平均墙钟时间。

**菌株和质粒构建**：从含有N端His标签的pET-28a(+)质粒中扩增了细胞色素P450BM3基因（GenBank: J04832.1）。使用带有野生型P450BM3作为模板的快速定点突变试剂盒（Tiangen）进行了定点突变。所有引物由中国上海的Generay Biotechnology公司合成。所得质粒随后被转化到大肠杆菌DH5α细胞中进行克隆筛选。所有突变序列通过上海Sangon Biotech公司的Sanger测序进行了验证。CYP116B46基因来源于Tepidiphilus thermophilus（GenBank, WP_055423153.1），由Sangon Biotech有限公司合成，然后转化到大肠杆菌BL21（DE3）中用于重组蛋白表达。CYP116B46突变体是根据制造商说明书使用快速定点突变试剂盒构建的。

**酶纯化和定量**：野生型/突变型质粒被转化到大肠杆菌BL21(DE3)中以异源表达酶。重组的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在含有50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养。在37°C下以220 rpm的速度摇动培养后，细胞生长至OD600为0.8–1.0。然后加入IPTG至最终浓度0.1 mM并在20°C下培养。再培养12小时后，于4°C下以8000 × g离心5分钟收集细胞。细胞沉淀物重新悬浮在裂解缓冲液（50 mM Tris–HCl缓冲液，10 mM咪唑，pH 7.5）中，并通过超声处理裂解细胞。细胞碎片通过在4°C下以18,000 × g离心15分钟去除。上清液通过0.22 μm过滤器过滤。接着，使用?KTA纯化系统将裂解物加载到HisTrap HP亲和柱上。WT/突变样品用洗脱缓冲液（50 mM Tris–HCl缓冲液，50, 100, 500 mM咪唑，pH 7.5）洗脱，目标蛋白用100 mM洗脱缓冲液（50 mM Tris–HCl缓冲液，100 mM咪唑，pH 7.5）洗脱。通过8% SDS-PAGE分析酶的纯度，活性部分也进行了50 mM Tris-HCl（pH 7.5）缓冲液的缓冲液交换。使用分子量截断为30 kDa的Amicon Ultra（Millipore）浓缩酶，并在4°C下进行了三次每次20分钟的离心步骤。纯化目标蛋白的浓度用BCA蛋白测定试剂盒确定。

**酶活性和动力学研究**：活性测定使用Multiskan Sky微孔板光谱仪（Thermo Scientific）进行。反应混合物（0.1 mL）含有0.75 mg/mL的纯化酶、0.3 M葡萄糖、1 M NaCl、2 mM NMNH和0.2 M PBS缓冲液（pH 7.5）。在30°C预孵育2分钟后，加入80 μM细胞色素c（Sigma-Aldrich）开始反应，并在550 nm处监测（ε550 = 21.1 mM?1cm?1）。对照组不包含NMNH。NMNH按照先前描述的方法制备。酶活性定义为实验组和对照组之间细胞色素c还原量的差异，一个单位（U）表示在30°C（pH 7.5）下每分钟还原1 nmol细胞色素c所需的酶量。数据以平均值±标准差表示。为了确定动力学参数，酶浓度固定在6.25 nM，而细胞色素c浓度在3.125至160 μM之间变化。所有测量均重复三次。动力学参数（Kcat和KM）通过OriginPro 9.0使用Michaelis-Menten方程的非线性回归拟合获得。使用12-pNCA作为底物，测定了P450BM3和S848R/W1047S/T906A的催化效率。反应在30°C下于50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中进行，酶浓度为50 nM。底物浓度范围从0.005 mM至0.3 mM。NADPH或NMNH作为辅因子，浓度为1 mM。反应通过加入辅因子启动，并通过测量410 nm处吸光度的增加来监测p-硝基酚的形成。通过反应开始后的30-150秒区间内的线性回归获得初始速率。动力学参数（Km, kcat）通过Origin 9.0软件使用Michaelis-Menten方程拟合得到。CYP116B46及其变体的催化活性使用2-羟基苯乙酸（2-HPA）作为底物进行评估。反应在30°C下于50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中进行，酶浓度为0.5 μM，总体积为200 μL。加入NADPH或NMNH至最终浓度1 mM以启动反应。为了终止反应并去除蛋白质，将反应混合物与400 μL乙腈混合后以12,000 × g离心10分钟。上清液转移到小瓶中并通过超高性能液相色谱-质谱（UPLC-MS）分析。色谱分离在C18反相柱（2.1 × 100 mm，1.7 μm颗粒大小）上使用水和乙腈的梯度洗脱在30°C下进行，流速为0.2–0.3 mL/min。质谱仪采用全扫描负电喷雾电离（ESI?）模式在m/z范围100–1000内运行。通过保留时间和质荷比与真实HGA标准品比较进行产物鉴定。与HGA相关的信号进一步使用m/z 167的提取离子色谱图分析。

**定量和统计分析**：在NMNH支持条件下，通过微孔板读数器在550 nm处监测吸光度变化来光谱法测定细胞色素c还原活性。在NADPH/NMNH支持条件下，通过微孔板读数器在410 nm处监测吸光度变化来光谱法测定12-pNCA底物的氧化活性。速率从吸光度-时间曲线的线性部分计算得出。初始速率数据使用OriginPro 9.0通过非线性回归拟合到Michaelis–Menten方程。在相应表格或图例中指定的情况下，参数不确定性从三次测量中估计，并报告为平均值±标准差或95%置信区间。

**补充信息（2）**：下载所有PDF文件（1.71 MB）包括图S1–S16和表S2–S4；电子表格（17.74 KB）包括表S1：ICNNMD预测的S848R/W1047S的氨基酸得分排名。