Xen-Spat：面向肿瘤微环境成像空间转录组数据的细胞共定位定量分析流程

《Genes》：Xen-Spat: An Analysis Pipeline for Imaging-Based Spatial Transcriptomic Data to Quantify Cellular Colocalization in the Tumor Microenvironment

　　

：成像型空间转录组平台可在完整组织内测量单细胞基因表达，但细胞类型注释与空间分析通常由不同工具分别完成。研究人员开发了Xen-Spat，一种分析流程，可将同一套细胞类型标签贯穿于肿瘤微环境中细胞共定位的互补性度量。方法：对细胞进行质控过滤，在每个样本内分两级进行注释，并映射至统一的细胞类型标签。应用了四个空间模块：用于区域共定位的Morisita指数、通过Dice系数分配肿瘤生态位的生态位分析、带热点重叠量化的Getis-Ord Gi*热点检测，以及结合伪批量差异表达的距离富集分析。结果：在六例经10x Xenium分析的HER2+乳腺癌活检样本中，每个样本均有一个生态位被分配至肿瘤区室（Dice系数0.60至0.83，而其他生态位不高于0.22）。在所有六例样本中，巨噬细胞在肿瘤细胞25 μm范围内富集；在排除受分割溢漏影响的基因后，肿瘤细胞附近与边缘巨噬细胞间存在50个差异表达基因。在一个独立的公开Xenium数据集中，该流程重现了已报道的组织区域间MMP11表达差异。结论：Xen-Spat为量化成像型空间转录组数据中的细胞共定位提供了一种可重复的工作流程。

论文解读

一、研究背景与问题

空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）技术能够在保留空间背景的同时，以单细胞分辨率测量RNA转录本，使研究者得以观察肿瘤与间质组织内的基因表达模式，并解析构成异质性微环境的独特邻域。成像型平台如Xenium和CosMx现可在完整组织切片内以亚细胞分辨率测量数百种转录本。然而，随着数据生成能力的快速增长，数据分析能力的滞后日益凸显。尽管Seurat、Scanpy、Squidpy和Giotto等软件包提供了系统化的单细胞分析流程，涵盖预处理、标准化、降维、聚类与细胞类型注释，但空间分析通常需要用户自行拼接多个独立工具，这些工具在输入格式与细胞类型标签定义上各不相同。具体而言，肿瘤与间质区室通常依赖病理学家注释或手工绘制的感兴趣区域，难以在队列中一致应用；热点方法能识别细胞类型聚集的区域，却无法量化两种细胞类型热点之间的重叠面积；由于邻近性、生态位与热点测量分别生成，难以将单一观察结果从一种度量追踪至另一种。这些空白促使研究人员开发Xen-Spat，以统一标签贯穿四种空间度量，实现自动化、可重复的细胞共定位定量分析。

二、研究内容与结论

研究人员开发了Xen-Spat分析流程，在六例HER2+乳腺癌活检样本（10x Xenium平台，280基因乳腺基因面板加50基因定制面板）及一个独立公开Xenium数据集中验证其可行性。结论表明，该流程能够自动分配肿瘤与间质生态位，量化任意细胞类型对的热点重叠面积，并在统一细胞类型标签体系下报告所有测量结果。在六例发现队列中，每例样本均有一个生态位被明确分配至肿瘤区室（Dice系数0.60至0.83，其他生态位不高于0.22）；巨噬细胞在所有样本中均于肿瘤细胞25 μm范围内富集，且经分割溢漏校正后鉴定出50个差异表达基因。在独立验证队列中，流程重现了已报道的MMP11表达区域差异，证实其跨数据集的可转移性。该流程以文档化工作流形式发布，提供逐步指导与参数敏感性分析，为空间转录组数据的标准化分析提供了可复制的路线。

三、关键技术方法

Xen-Spat整合了多项关键技术。样本来源为杜克大学医院获取的六例HER2+原发性乳腺癌新鲜冷冻核心针活检组织，以及一个公开的12例FFPE乳腺癌Xenium数据集（其中本研究分析4例切片）。单细胞分析采用Scanpy流程，包括质控过滤、对数标准化、主成分分析、Leiden聚类与两级细胞类型注释，最终映射至统一标签。空间分析包含四个模块：Morisita指数（10×10网格划分组织区域，量化细胞类型对的区域共定位）；Seurat BuildNicheAssay生态位分析（每细胞25个最近邻，k-means聚类生成生态位，以Dice系数自动分配肿瘤与间质区室）；基于R地理空间分析包（spatstat、sp、spdep、sf）的Getis-Ord Gi*热点检测（核平滑、128×128栅格、8邻域空间权重，z-score>1.96且p<0.05定义热点，轮廓叠加计算重叠面积）；以及距离富集分析（以肿瘤细胞为参照，<25 μm为近、25–75 μm为边缘、>75 μm为远，伪批量差异表达采用PyDESeq2，以患者为协变量，并排除72个易受分割溢漏影响的基因）。

四、研究结果

1. 1.
   单细胞分析流程分析乳腺癌ST数据：经质控后每例样本保留18,002至120,038个高质量细胞。两级注释结合主要簇与子集簇，鉴定出肿瘤细胞、基底上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、肌上皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞、CD8 T细胞、T细胞、Tregs、NK细胞、B细胞和肥大细胞共14种统一标签细胞类型。肿瘤细胞（32.31%±11.27）、巨噬细胞（16.05%±8.79）、成纤维细胞（15.11%±11.52）和内皮细胞（7.83%±3.06）存在于所有样本，免疫细胞类型变异尤为显著。
2. 2.
   估计肿瘤微环境中的细胞类型共定位：Morisita指数在样本097中显示树突状细胞与T细胞高度共定位（0.96），样本100中肿瘤细胞与巨噬细胞共定位值达0.81。四象限图与密度投影确认了度量预测的空间邻近性。该指数受细胞丰度影响，原始值仅反映样本内相对共定位，不宜跨丰度差异大的细胞类型对或跨样本直接比较。
3. 3.
   自动化鉴定多细胞富集生态位：生态位分析显示高免疫浸润样本097中B细胞和T细胞存在于每个生态位，反映广泛免疫浸润；低浸润样本100中多个生态位以单一细胞类型为主。通过Dice系数自动分配，每例样本均有一个生态位显著高于其他（0.60至0.83对0.22及以下），被标记为肿瘤生态位，其余合并为间质区室。该方法为缺乏清晰结构或病理注释的组织提供了可重复的区室分配方案。
4. 4.
   地理空间分析热点检测：Getis-Ord Gi*统计识别出各细胞类型的高密度聚集区域。在样本100中，67%的CD8 T细胞热点面积（4.56/6.80 mm2）与肿瘤细胞热点重叠（肿瘤热点总面积7.76 mm2），与Morisita指数显示的紧密空间邻近一致。热点数量在低k值下较高，k超过16后趋于平台期。
5. 5.
   基于距离的细胞类型富集分析：以肿瘤细胞为参照划分近、边缘、远三个距离区。巨噬细胞在全部六例样本中均于肿瘤细胞附近富集。经排除72个易受分割溢漏影响的基因后，50个基因在近肿瘤与边缘巨噬细胞间差异表达：近肿瘤巨噬细胞高表达HAVCR2（TIM-3）、APOBEC3A、WNT5A和C15orf48，边缘巨噬细胞高表达MRC1（CD206）、FCER1A和IGF1。上皮转录本在巨噬细胞中于肿瘤细胞10 μm内最高，50 μm后降至基线，成纤维细胞呈现相同模式，提示分割溢漏而非巨噬细胞自身表达。
6. 6.
   独立队列应用：在公开Xenium数据集的S1_TOP样本中，巨噬细胞与T淋巴细胞高度共定位。热点分析显示增殖性肿瘤细胞与T细胞间空间重叠极小。在S1_Bottom样本中，生态位分析揭示两个病理学上均描述为DCIS伴粉刺样坏死的区域存在清晰差异，且区域1（富增殖性肿瘤细胞）中MMP11、MKI67、RRM2、TOP2A、CCNB1和TYMS转录本丰度均高于区域2，与原始报道一致。S2_TOP（正常乳腺）无肿瘤标签，所有生态位Dice系数均为0.000，提示无肿瘤存在而非分区失败。

五、讨论与结论

讨论部分指出，Xen-Spat的贡献在于组合而非单个组件，三项能力为现有工具所不具备：自动定义肿瘤与间质区室（无需病理注释）、热点共定位以面积而非距离量化、四个模块读取统一标签对象使度量间直接可比。区室自动分配依赖Dice系数形成可分离的两组；在核心活检中最大间隙为次大间隙的3.9至28.5倍，而整个切除面样本中比值为1.2至1.7，提示弥散浸润组织中肿瘤含量跨生态位连续变化。当所有生态位Dice系数均低时，最大间隙可能落在小值之间，需同时检查分割上方最低系数（本研究中均≥0.45）。流程在Python与R环境间跨越而非统一，共定位度量筛选候选相互作用但不建立配体-受体信号，且目前仅验证于单细胞分辨率成像平台。

研究结论：Xen-Spat提供了从成像型空间转录组数据单细胞注释到四种组织定量描述的连续路径：Morisita指数区域共定位、多细胞生态位、地理空间热点及其成对重叠、距离分箱的细胞类型富集及关联差异表达。应用于六例HER2+乳腺癌活检及独立Xenium队列的四例样本，流程恢复了预期的免疫浸润范围，无需手动注释即分离肿瘤与间质区室，并重现了已报道的空间生态位间MMP11表达差异。工作流、参数敏感性分析与实例可在GitHub获取。自动化区室分配与热点重叠模块预计对其它肿瘤类型和更大队列最具可转移性。