黑视蛋白诱发的钙信号时序模式启动与 NF-κB 相关的转录及磷酸化蛋白组学反应

《iScience》：Temporal patterns of melanopsin-evoked calcium signaling engage NF-κB-associated transcriptional and phosphoproteomic responses

　　

# 要点
* 黑视蛋白刺激的时间模式引发不同的转录反应
* TNF 和 IL8 对刺激频率和时间规律性表现出不同的敏感性
* 转录组学鉴定出一种 MYC 相关基因表达特征
* 磷酸化蛋白质组学鉴定出与时间信号传导相关的候选激酶网络

# 摘要
细胞利用振荡性钙（Ca2+）信号来调节多种生物过程，时间动力学提供了细胞内信息的一个潜在层面。我们利用光遗传学激活 Gαq 偶联的光感受体黑视蛋白，在人类非兴奋性细胞中施加定义的慢速或快速时间刺激模式，从而引发振荡性 Ca2+ 相关信号，同时保持受体近端信号传导。快速、规律的黑视蛋白刺激比时间上不规律的刺激诱导了更强的核因子 κB（NF-κB）相关肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素 -8（IL8）表达，而 TNF 和 IL8 对刺激频率表现出部分不同的反应。转录组分析发现了一种 MYC 相关基因表达程序，尽管 MYC 转录本水平未变。整合转录组学和磷酸化蛋白质组学数据集，鉴定出涉及 PRKDC、CHEK2 和 ATM 的候选激酶网络，可能将时间模式化信号与细胞周期和应激反应通路联系起来。总之，这些发现表明，黑视蛋白引发的信号的不同时间模式与不同的转录和磷酸化信号反应相关，突显了时间动力学作为细胞内信息处理特征的重要性。

# 图形摘要

# 引言
信号传导存在于所有细胞中，用于调节细胞内过程并与邻近细胞交流其状态。每个细胞大约有 20 种不同的细胞内信号转导通路，存在大量的相互作用。其中，几种与 Ca2+ 信号传导有关（例如，环 ADP 核糖信号传导、电压/受体操作通道，以及涉及磷脂酶 C 激活的通路），它参与广泛的进程，包括受精、细胞凋亡、增殖、分化、肌肉收缩和学习。,, Ca2+ 作为信息介质的卓越多功能性源于其广泛的空间和时间多样性，使其能够产生高度变化的模式。在时间上，Ca2+ 浓度可以周期性振荡，由多种转运蛋白的活动驱动。Ca2+ 振荡频率的调节已被证明可以控制各种细胞功能。例如，在发育中的大脑中，环境中的 γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸刺激中间神经元迁移。当到达皮层时，钾氯共转运体 KCC2 的上调降低了自发 Ca2+ 活动的频率，从而减少迁移。在迁移后的锥体神经元中，随着分支树突数量的增加，Ca2+ 振荡的频率增加。与发育障碍诺昂综合征相关的 SHP-2/PTPN11 功能获得性突变，增强了 Ca2+ 振荡对 NFAT（活化的 T 细胞核因子）的频率依赖性控制，这可能有助于先天性心脏缺陷。在胰腺β细胞中，Ca2+ 振荡的频率控制线粒体 ATP 合成，进而驱动胰岛素分泌。同样，胶质瘤细胞形成功能性网络并表现出精细调节以促进增殖的自发 Ca2+ 振荡，可能通过 NF-κB（活化的 B 细胞轻链增强子）。这种活动与源自小鼠胚胎干细胞发育神经前体的动力学相似。,

编码在 Ca2+ 振荡中的生物信息通过各种细胞内分子解码，这些分子根据这些信号调整其活性。已经提出了几种用于频率解码的分子机制，迄今为止已鉴定出少数特定的解码器。这些包括 NF-κB、核因子活化的 T 细胞（NFAT）,, MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）、PKC（蛋白激酶 C）、CaMKII（Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II）和钙蛋白酶。NF-κB 和 NFAT 主要解码 1–100 mHz 范围内的低频信号，而 CaMKII 则在 0.1–1 Hz 的较高频率范围内运行。这种在频率域上的分离主要由 NF-κB 和 NFAT 作为频率解码的基础机制在细胞核之间穿梭来解释，而 CaMKII 的解码取决于由 Ca2+ 和钙调蛋白结合调节的自身磷酸化。

光遗传学是指利用光来控制表达光敏蛋白的基因修饰细胞。,, 通常，通过刺激不同版本的阳离子通道通道视紫红质 -2 或氯泵卤视紫红质，兴奋性细胞如神经元被激活或抑制。黑视蛋白是一种由人类 OPN4 基因编码的 Gαq 蛋白偶联受体，表达于内在光敏感视网膜神经节细胞中，在调节昼夜节律中起关键作用。蓝光光谱中的光被结合在黑视蛋白上的维生素 A 衍生物视黄醛吸收，导致其从 11-顺式视黄醛异构化为全反式视黄醛。激活后，黑视蛋白通过肌醇 -1,4,5-三磷酸（InsP3）受体（InsP3R）触发内质网（ER）释放 Ca2+。此前，黑视蛋白已在非兴奋性细胞中表达，以实现光控制的 NFAT 活性调节。

在本研究中，我们检测了毫赫兹范围内黑视蛋白刺激模式的转录组学和磷酸化蛋白质组学反应，这与以往专注于特定解码器以检测其动力学的研究不同。我们利用黑视蛋白的异源表达来施加定义的时间刺激模式，从而引发重复的 Ca2+ 反应，并研究非兴奋性细胞系中的下游时间解码。我们分析了 NF-κB 相关的转录反应，发现肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素 -8（IL8）对时间刺激模式表现出不同的敏感性。我们通过批量 RNA 测序预测了一个与 MYC 相关的频率依赖性基因网络。最后，磷酸化蛋白质组学鉴定出差异磷酸化模式和候选激酶网络，可能将时间模式化的黑视蛋白引发的信号与细胞周期和应激反应通路联系起来。

# 结果
**光遗传学诱导重复性 Ca2+ 反应**
为了建立生成重复性 Ca2+ 信号的光遗传学系统，我们开发了一种基于黑视蛋白激活的计算机控制光刺激装置（图 1A）。由蓝光激活的 Gαq 蛋白偶联受体黑视蛋白与 mCherry 共表达，被引入非兴奋性海拉细胞。细胞通过携带黑视蛋白基因 OPN4 与 mCherry 通过 IRES 序列共表达的构建体进行 lentivirus 转导（图 1B）。使用比率染料 Fura-2/AM 同时检测细胞内 Ca2+ 水平。为了激活黑视蛋白，我们使用了发射 470 nm 光的蓝色 LED。为了实时成像动力学以及黑视蛋白受体对细胞 Ca2+ 水平的影响，我们使用了配备单个 LED 的装置（图 S1A），而在培养箱内应用定义的时间黑视蛋白刺激方案时使用串联连接了六个 LED（图 S1B）。施加各种驱动电压来控制 LED 的辐射功率。测量单个 LED 与串联六个 LED 中一个 LED 发射的光，在分别施加 4.3 V 和 17 V 时显示出相似的辐射功率（图 S1C 和 S1D）。测试过表达黑视蛋白的细胞反应，结果显示在 5 秒蓝色 LED 刺激后出现明显的 Ca2+ 增加（图 1C）。Ca2+ 反应与磷脂酶 C（PLC）和 InsP3R 的参与一致，因为 5 μM 的 U73122（图 S2A）和 100 μM 的 2-APB（图 S2B）可以抑制该反应。携带仅含空载体的病毒的细胞对蓝色 LED 光不敏感（图 1D）。

**图 1 光遗传学控制细胞内钙信号**
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(A) 使用光遗传学控制 Ca2+ 信号传导的实验装置示意图。
(B) 黑视蛋白的 lentivirus 表达载体。
(C) 转导了黑视蛋白表达载体的五个细胞的平均 Ca2+ 轨迹和 SEM。蓝色标记表示 5 秒的光刺激。
(D) 与 (C) 相同，但针对转导了空载体的细胞。
(E) 光刺激的峰值 Ca2+ 反应与 mCherry 强度的关系散点图。每个点代表一个细胞。红色区域代表 Ca2+ 反应随 mCherry 荧光增加的细胞，而蓝色区域代表无反应细胞。
(F) 三个分选细胞群体的 mCherry 强度分布。
(G) 重复光刺激下具有特定反应率的细胞数量。
(H) 重复光刺激的长期 Ca2+ 成像。
(I) 光刺激引发的 Ca2+ 峰值宽度。每个箱线图代表来自单个细胞的峰值宽度，显示中位数、第 1 四分位数和第 3 四分位数（箱体边缘）以及延伸至四分位距 1.5 倍范围内最远点的须。
另见附图 S1 和 S2

LED 的 5 和 4.3 V 驱动电压均导致了明显的 Ca2+ 反应（图 S2C）。在一组用蓝光刺激的分选细胞中，出现了两个不同的子群（图 1E）。在一个子群中（蓝色区域），无论 mCherry 荧光如何，细胞均缺乏光敏感性。在另一个子群中（红色区域），mCherry 荧光较强的细胞比荧光较弱的细胞表现出更强的 Ca2+ 内流。这些数据表明，我们确实可以通过光遗传学控制细胞内 Ca2+ 浓度。

**表达黑视蛋白的稳定细胞系**
接下来，我们寻求建立稳定的黑视蛋白表达细胞。由于 Ca2+ 反应因 mCherry 表达而异（图 1E），通过流式细胞术将转导细胞分选为三组：空载体、低黑视蛋白表达和高黑视蛋白表达（图 1F）。mCherry 荧光对应于黑视蛋白表达，并通过使用 OPN4 引物的 RT-qPCR 验证（图 S2D 和 S2E）。为了确定长期光刺激是否对细胞有害，我们将细胞暴露于每分钟 5 秒的光脉冲中，持续 12 小时。这种刺激对细胞无毒害，因为形态未受影响（图 S2F），且早期凋亡标志物膜联蛋白 V 没有增加（图 S2G 和 S2H）。表达空载体、低黑视蛋白或高黑视蛋白的细胞观察到类似结果。为了控制潜在的低水平光毒性，所有后续实验均归一化至空载体和未刺激对照细胞，从而考虑了转基因表达和光照暴露。因此，光本身或由此产生的 Ca2+ 内流均未引起细胞凋亡。在黑视蛋白高表达细胞系中，在 20 分钟的重复光刺激下，约 40% 的细胞具有 100% 的反应率（约 30% 具有 90% 的反应率，约 20% 具有 80% 的反应率）（图 1G 和 1H）。光引发的 Ca2+ 反应在细胞间明显同步（图 1H），尽管重复光刺激下产生的 Ca2+ 信号的峰值宽度在每个细胞中略有不同，但一般在 20–40 秒左右（图 1I）。

**对不同黑视蛋白刺激频率的 NF-κB 相关反应**
为了验证我们的实验系统，我们首先关注 NF-κB，已知其可解码 Ca2+ 振荡的频率。为了检查 NF-κB 相关的转录如何对不同黑视蛋白刺激频率做出反应，我们使用了基于荧光素酶的报告基因测定法。细胞要么每分钟刺激一次（15 mHz），要么每两分钟刺激一次（8 mHz），持续 1 小时。为了测试协同因子的必要性，在样本的一半中补充了 100 nM 的黑视蛋白协同因子全反式视黄醛（ATR）。萤火虫荧光素酶活性归一化至海肾荧光素酶，并相对于无刺激的空载体且无 ATR 的细胞表达（图 2A）。因子方差分析揭示了刺激条件（F(2,40) = 27.71, p = 2.8 × 10?8）、黑视蛋白表达水平（F(2,40) = 40.00, p = 2.9 × 10?10）和 ATR 补充（F(1,40) = 8.97, p = 0.0047）对 NF-κB 相关转录活性的显著影响。在刺激与黑视蛋白表达（F(4,40) = 11.52, p = 2.6 × 10?6）、刺激与 ATR 补充（F(2,40) = 16.72, p = 5.3 × 10?6）以及黑视蛋白表达与 ATR 补充（F(2,40) = 8.96, p = 6.1 × 10?4）之间也观察到显著的交互效应。黑视蛋白表达组之间以及 ATR 条件下的基线差异表明，黑视蛋白表达和/或视黄醛补充可能会轻微影响基础 NF-κB 报告基因活性。因此，解释主要集中在条件内的刺激效应。NF-κB 相关的转录活性随黑视蛋白刺激频率增加，更快的刺激方案产生更强的报告基因活性（图 2B）。光诱导的 NF-κB 相关报告基因活性增加与急性脂多糖（LPS 诱导的报告基因系统激活）处于相似的量级（图 S3A）。

**图 2 对不同黑视蛋白刺激频率的 NF-κB 相关反应**
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(A) 通过荧光素酶测定法测量的 NF-κB 相关转录。萤火虫荧光素酶活性归一化至海肾荧光素酶，并相对于未刺激对照表达。
(B) 仅针对使用添加 ATR 的高黑视蛋白细胞的实验，来自 (A) 的数值作为频率的函数。
(C) 通过 RT-qPCR 测量的一组依赖于 NF-κB 的基因表达。
(D) IP3R 抑制剂 2-APB (100 μM) 和 NF-κB 通路抑制剂 SC-514 (50 μM) 和 Ro 106–9920 (10 μM) 对 TNF 和 IL8 诱导的影响。

SC-514优先降低了TNF的诱导，而Ro 106-9920更明显地降低了IL8的诱导；2-APB同时降低了两者的诱导。（E）TNF和IL8的表达与频率的关系在更宽的跨度上进行了展示。p值通过因子方差分析后结合Tukey事后多重比较检验计算得出；n = 3为独立培养的平均值和标准误。? p <0.05，?? p <0.01，??? p <0.001。(B)中的星号指示了在补充ATR的视黑素高表达细胞中选取的事后比较结果。另见图S3。

接下来，对一组已知依赖NF-κB的基因（MYC、TNF、BAX、BCL2、CCND1和IL8）使用RT-qPCR进行检测。仅使用了添加了ATR的视黑素高表达细胞系。TNF表达在快速刺激方案下显著增加，但在缓慢刺激方案下未显著增加（p = 0.00607和p = 0.13868，分别为，N = 3），而IL8表达在快速和缓慢刺激后均显著增加（p = 0.00757和p = 0.03606，分别为，N = 3）（图2C）。为评估NF-κB相关信号传导对基因诱导的贡献，将细胞分别与50 μM SC-514（IKKβ抑制剂）或10 μM Ro 106-9920（IκBα泛素化抑制剂）孵育。SC-514优先降低了TNF的诱导（p = 0.003475，N = 3），而Ro 106-9920更明显地降低了IL8的诱导（p = 0.00211，N = 3）（图2D），表明存在部分不同的或基因特异性的调控效应。此外，使用100 μM InsP3R抑制剂2-APB处理降低了TNF和IL8的诱导（p = 0.043444和p = 0.019994，分别为，N = 3），这与Ca2+相关信号传导的参与一致。令人惊讶的是，暴露于12小时缓慢或快速视黑素刺激的细胞并未显示出显著的TNF或IL8诱导（图S3B和S3C）。为进一步表征IL8和TNF表达对视黑素刺激频率的依赖性，我们在更宽的频率范围内刺激了细胞。有趣的是，基因表达呈现出对视黑素刺激频率的近似S形依赖性，在高频率刺激下具有明显的趋于饱和的趋势（图2E）。

## 时间刺激模式对TNF和IL8表达的影响

为调查视黑素刺激的时间规律性是否影响IL8和TNF的表达，我们使用时间不规则的光脉冲序列刺激细胞。细胞暴露于1小时内不规则分布的55个光脉冲（图3Ai，下方轨道）。在刺激间隔中，36%为60秒或更短（图3B红色区域）。值得注意的是，与规律性刺激方案相比，随机刺激方案下的基因诱导显著减弱（p = 0.022434和p = 0.010417，N = 3；图3C）。接下来，我们比较了具有相同光脉冲数量但不同刺激频率和持续时间的刺激方案。具体而言，细胞或每隔2分钟刺激一次持续1小时（30个脉冲，对应8 mHz），或每隔1分钟刺激一次持续半小时（30个脉冲，对应15 mHz），随后半小时不进行任何刺激（图3Aii，分别为上方和下方轨道）。TNF诱导在较慢的刺激方案后显著较低（p = 0.047527，N = 3），而IL8表达在两种方案之间无显著差异（p = 0.420798，N = 3，图3D）。总体而言，这些结果表明TNF和IL8的表达对视黑素刺激的时间模式敏感，尽管两个基因对刺激频率和时机的反应存在差异。

### 图3 TNF和IL8表达在不同时间视黑素刺激模式间存在差异

- **(A)** 两种不同光刺激范式的示意图：(i) 随机刺激和 (ii) 以不同刺激频率和持续时间提供相同数量的光脉冲。
- **(B)** 范式(i)中光脉冲之间暂停时间的分布。红色区域表示暂停时间少于60秒。
- **(C)** 随机刺激范式(i)下TNF和IL8的诱导较低。
- **(D)** TNF但非IL8的诱导在刺激范式(ii)下较低。p值通过单因素或双因素方差分析后结合Tukey事后多重比较检验计算得出；n = 3为独立培养的平均值和标准误。? p <0.05，?? p <0.01。

## 对不同视黑素刺激频率的转录组应答

接下来，我们以无偏的方式研究了不同时间视黑素刺激方案下的转录应答。为评估不同视黑素刺激频率下的转录组应答，我们将细胞以每分钟一次（约15 mHz刺激）或每两分钟一次（约8 mHz刺激）的光脉冲刺激1小时或12小时。实验结束后，细胞被裂解并制备用于RNA测序。总共32个批量样本（每个约500个细胞）进行多重检测和测序，采用分子计数方法。为控制光本身或异源表达的任一非特异性或毒性效应，分析同时控制了未刺激细胞以及仅表达空载体的细胞。直接比较表达空载体的细胞有或无光刺激后，未产生任何显著差异表达基因（DEGs）（数据未展示）。

主成分分析（PCA）显示样本按细胞类型（表达视黑素的细胞与空载体细胞）形成不同聚类，PC1和PC2分别解释了84%和5%的方差（图S4A）。PC1方向上的分离表明两组之间存在明显的转录差异。同时考虑刺激类型（1小时或12小时的低频和高频）也显示出聚类（图S4B）。为评估主成分（PCs）与Cell_type变量（视黑素 vs. 空载体）之间的关系，进行了Kruskal-Wallis检验。在PC1（χ2 = 21.05，p = 4.47 × 10?6）和PC4（χ2 = 7.29，p = 0.006933）中发现显著差异，但在PC2、PC3或PC5中未发现（p > 0.05）。评估PCs与刺激变量（五种状态）之间的关系显示PC2与刺激之间存在显著关联（χ2 = 15.7，p = 0.0034），而PC1、PC3、PC4和PC5在刺激条件间未显示显著差异（p > 0.05）（数据未展示）。

RNA测序分析鉴定出1小时刺激后快速（15 mHz）和缓慢（8 mHz）视黑素刺激方案之间的215个DEGs，以"8 mHz"作为参考水平（图4A；表S1）。其中，131个基因在快速刺激方案相对于缓慢方案中表达上调，84个基因表达下调。12小时刺激后，鉴定出快速和缓慢刺激方案之间的27个DEGs（17个上调，10个下调），再次以缓慢（8 mHz）条件作为参考（图S5A；表S2）。值得注意的是，1小时和12小时刺激的DEGs之间没有重叠，表明1小时和12小时刺激后存在不同的转录终点谱。为确定快速和缓慢刺激方案之间的转录差异是否与视黑素表达特异性相关，我们额外进行了交互模型分析，检测快速与缓慢响应在视黑素和空载体对照细胞之间是否不同。在1小时，该分析鉴定出78个基因在快速和缓慢刺激方案间表现出显著的细胞类型依赖性差异（表S3），其中包括23个与加和模型DEGs重叠的基因。这些重叠基因代表了视黑素依赖性转录应答响应于时间刺激方案的更高置信度候选基因，而加和模型DEGs则更广泛地代表了与快速与缓慢刺激比较相关的转录应答。相比之下，尽管在12小时时能检测到名义上的交互水平信号，但没有基因在全转录组多重检验校正后存活。鉴于视黑素引发的信号传导在整个12小时刺激期间的持续未得以确认，该差异的机制基础无法从现有数据中确定。

### 图4 1小时视黑素刺激后对快速和缓慢刺激的转录组应答

- **(A)** 1小时刺激的批量RNA-seq数据火山图，展示log2折变（x轴）与-log10调整p值（y轴）。调整p值<0.05的基因被突出显示：上调基因标记为红色，下调基因标记为蓝色。非显著基因显示为灰色。每个条件的独立生物学重复（培养）n = 3。
- **(B)** 转录组数据的基因集富集分析结果富集图。富集图显示了1小时使用MSigDB的Hallmark基因集通过基因集富集分析（GSEA）鉴定出的显著通路。x轴表示列表中基因的排序，y轴表示运行富集分数。x轴上的刻度标记表示相应基因集中基因在排序列表中的位置。假发现率（FDR）<0.05的通路被视为显著富集。

另见图S5。

对1小时加和模型DEGs的功能富集分析揭示了翻译和核糖体相关过程的广泛富集，包括细胞质翻译、核糖体生物发生、RNA结合、蛋白结合和细胞组织相关术语。为确定这些功能主题是否在表现出视黑素依赖性响应的基因中保留，使用1小时交互模型DEGs重复进行了富集分析。尽管基因集更小且更严格，交互模型DEGs显示出重叠的生物类别富集，包括核糖体结构组成、RNA结合、细胞质翻译、核糖体亚基生物发生、应激反应调控、细胞质核糖体、细胞外小泡和局灶黏附。这些发现表明，翻译/核糖体和细胞组织程序与对不同时间刺激方案的早期应答相关，其中一部分显示出视黑素依赖性效应。

为确定刺激相关基因表达变化的潜在调节因子，我们应用ChEA3——一种基于网络的转录因子富集分析工具——对1小时和12小时刺激后快速与缓慢视黑素刺激方案之间的DEGs进行了分析。每个时间点富集的前10个转录因子列于表1中，并分别展示于图S6A和S6B中。

**表1** 基于MeanRank的ChEA3富集分析预测的前10个转录因子

| 实验条件 | 排名 | 转录因子 | MeanRank | 重叠基因 |
|---------|------|---------|----------|---------|
| 1 h | 1 | PA2G4 | 7.5282 | — |
| | 2 | ZNF888 | 13.133 | — |
| | 3 | ZNF146 | 38.3344 | — |
| | 4 | POU5F1B | 46.225 | — |
| | 5 | ZNF207 | 48.556 | — |
| | 6 | BPTF | 50.5237 | — |
| | 7 | PRMT3 | 53.338 | — |
| | 8 | MYC | 53.1711 | 6 |
| | 9 | HIF1A | 56.453 | 1 |
| | 10 | CENPA | 62.15 | — |
| 12 h | 1 | RFX | 8.9562 | — |
| | 2 | ZNF469 | 10.563 | — |
| | 3 | FOXD1 | 10.564 | — |
| | 4 | PRRX1 | 11.678 | 5 |
| | 5 | TWIST2 | 12.566 | — |
| | 6 | TWIST1 | 15.259 | — |
| | 7 | PRRX2 | 30.6758 | — |
| | 8 | HIF1A | 45.411 | 9 |
| | 9 | OSR2 | 51.5 | — |
| | 10 | FOXL1 | 62.336 | — |

MeanRank：所有转录因子-靶基因库中的平均排名。TF：转录因子。

随后，为1小时和12小时刺激条件分别构建了转录因子（TF）-基因调控网络。1小时网络由169个节点（10个TF和159个基因）和403条边组成（图5），可在NDEx上获取：TF_Gene_Regulatory_Network_1h。MYC相关的靶基因富集涵盖的基因数量最多（n = 116），其次是ZNF207（n = 56）和HIF1A（n = 53）。类似地，12小时网络包含26个节点（10个TF和16个基因）和68条边（图S5B），可在NDEx上获取：TF_Gene_Regulatory_Network_12h。对于12小时，HIF1A相关的靶基因富集涵盖的基因数量最多（n = 11）。

### 图5 1小时视黑素刺激后的转录因子-基因调控网络

使用快速与缓慢视黑素刺激方案下1小时刺激后差异表达基因（DEGs）构建的转录因子（TF）-基因调控网络。调控相互作用通过ChEA3计算推断。TF以黄色菱形节点表示，靶基因以圆形表示。节点大小对应-log10调整p值，颜色代表log2折变（log2FC）：红色表示上调基因，蓝色表示下调基因。边表示TF与其靶基因之间的调控相互作用。在推断的TF相关网络中，MYC与最多的靶基因相关（n = 116），其次是ZNF207（n = 56）和HIF1A（n = 53）。完整网络可通过NDEx获取，以交互式探索各个节点和相互作用。

另见图S5和S6。

基因集富集分析用于鉴定与1小时和12小时快速和缓慢视黑素刺激方案的转录组谱相关的所有显著富集通路（考虑所有基因）。使用DESeq2得出的排序基因列表通过MSigDB的Hallmark基因集进行分析。对于1小时刺激，GSEA鉴定出通路HALLMARK MYC TARGETS V1（MYC V1）、HALLMARK MYC TARGETS V2（MYC V2）、HALLMARK EPITHELIAL MESENCHYMAL TRANSITION（EMT）、HALLMARK INFLAMMATORY RESPONSE（INFLAMMATORY）和HALLMARK MTORC1 SIGNALING（MTORC1）的显著富集（图4B）。对于12小时刺激，GSEA揭示了通路HALLMARK_CHOLESTEROL HOMEOSTASIS（CHOLESTEROL）和HALLMARK APICAL JUNCTION的显著富集（图S5C）。此外，在进行基因集富集分析时，1小时和12小时刺激的结果之间没有重叠。

## 对不同刺激方案的蛋白质组和磷酸化蛋白质组应答

接下来，我们评估了快速和缓慢视黑素刺激方案的蛋白质组和磷酸化蛋白质组应答。

细胞以与其他实验类似的方式接受1小时的光脉冲刺激，随后进行磷酸化肽段富集和质谱分析（详见STAR Methods）。为了控制光照本身或过表达可能带来的任何非特异性或毒性效应，分析中设置了未刺激细胞以及仅表达空载体的细胞作为对照。此外，磷酸化肽段数值以肽段水平进行归一化，以控制蛋白质水平的上调或下调。

快速与慢速刺激方案差异丰度分析

蛋白质组学分析在快速（15 mHz）与慢速（8 mHz）黑视蛋白刺激方案之间鉴定出641种差异丰度蛋白（DAPs），其中慢速方案作为参考（表S4）。其中，193种蛋白在快速刺激方案中相对慢速方案上调，448种下调（图6A）。在磷酸化蛋白质组学数据集（以蛋白质丰度归一化）中，检测到211种差异丰度磷酸化肽段（DAPPs，表S5），其中109种为磷酸化上调肽段，102种为磷酸化下调肽段，同样以慢速（8 mHz）刺激方案作为参考（图6B）。这些肽段对应磷酸化上调组中的92个唯一蛋白标识符和磷酸化下调组中的87个唯一蛋白标识符。

图6 快速与慢速黑视蛋白刺激的蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学响应

（A和B）刺激后1小时蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学差异丰度分析的火山图。蛋白质组学（A）和磷酸化蛋白质组学（B）的火山图显示log2倍数变化（x轴）与-log10校正p值（y轴）的关系。校正p值<0.05的蛋白/磷酸化肽段被高亮显示：上调物种用红色表示，下调物种用蓝色表示，非显著性物种用灰色表示。

（C）加权文库对整合MeanRank激酶排名的贡献。柱状图显示前10位激酶的累积加权平均排名。所示激酶代表使用KEA3对差异丰度磷酸化蛋白进行计算预测的上游调节因子。x轴代表累积加权激酶排名，y轴列出排名靠前的激酶。彩色片段表示不同证据来源对各激酶排名的贡献。蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析使用独立的生物学重复（每种条件n=2–3）。

使用PC1和PC2对蛋白质组学数据进行主成分分析（PCA）显示样本间分离有限（图S4C）；然而，纳入PC3改善了按细胞类型（黑视蛋白vs空载体）的聚类，捕获了前两个主成分未能解释的额外方差（数据未显示）。相比之下，磷酸化蛋白质组学数据的PCA在使用PC1和PC2时未显示黑视蛋白与空载体样本之间的明显分离（图S4D）。在三维PCA图中纳入PC3略微改善了组间的视觉区分，但仍存在大量重叠，表明磷酸化蛋白质组学数据集中的主要方差来源并非仅由细胞类型差异驱动（数据未显示）。

差异丰度蛋白的功能富集分析

使用g:Profiler工具对DAPs进行GO和KEGG通路功能富集分析。前三个最显著的GO分子功能（MF）术语为"蛋白质结合"（GO:0005515）、"催化活性"（GO:0003824）和"ATP依赖性活性"（GO:0140657）。在GO生物过程（BP）术语中，最显著的是有丝分裂细胞周期过程（GO:1903047）、细胞器组织（GO:0006996）和小分子代谢过程（GO:0044281）。前三个GO细胞组分（CC）术语包括细胞质（GO:0005737）、染色体乘客复合体（GO:0032133）和吞噬小泡（GO:0045335）。

激酶富集分析揭示磷酸化变化的潜在调节因子

为鉴定可能与所观察磷酸化肽段丰度相关的候选上游激酶，将对应的蛋白集合转换为HGNC基因符号并提交至KEA3。磷酸化上调和下调蛋白的前10位富集激酶列于表2，并在图6C中展示。

蛋白集合 | 排名 | 激酶 | MeanRank | 重叠蛋白 | 差异丰度磷酸化蛋白
1 | CSNK2A1 | 16.09 | 15
2 | CHEK2 | 26.09 | 4
3 | ATR | 27.45 | 8
4 | ATM | 27.75 | 10
5 | CSNK2A2 | 28.16 | 6
6 | PRKDC | 34.18 | 3
7 | MASTL | 42.66 | 3
8 | CDK2 | 43.51 | 2
9 | AURKA | 456 | 5
10 | CDK1 | 45.09 | 12

表2 KEA3激酶富集分析鉴定的前10位（基于MeanRank）激酶
MeanRank：激酶在其出现的所有文库中的平均排名。

将转录组学结果与磷酸化蛋白质组学关联

为探索连接转录组学和磷酸化蛋白质组学响应的潜在调控关系，我们使用转录因子和激酶富集分析整合了两个数据集。首先，鉴定了可能与推断转录因子相互作用的蛋白。总共103个互作蛋白满足最低标准并被保留。其中，95个在RNA测序实验的RNA水平上被检测到。该列表被用作KEA3的输入，检索了前10位预测激酶（表3）。值得注意的是，10位预测激酶中有5位同时在互作蛋白富集激酶和差异丰度磷酸化蛋白预测激酶中共享：PRKDC（DNA依赖性蛋白激酶催化亚基）、CHEK2（检查点激酶2）、ATM、ATR（丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ATM和ATR）和AURKA（极光激酶A）。该网络代表候选调控关系，不应被解释为直接激酶激活的证据。该网络由109个节点（8个转录因子、91个互作蛋白和10个预测激酶）和1,006条边组成（图7）。该网络也可在NDEx上获取：表达-激酶调控网络。需要注意的是，与激酶没有直接或间接连接的转录因子和互作蛋白已被排除在网络之外。

图7 整合的转录因子-互作蛋白-激酶调控网络

表达-激酶调控网络。该网络代表转录因子（TF）、互作蛋白和激酶之间的候选推断调控关系，并不意味着直接的实验验证。该网络展示了相互作用。激酶以绿色矩形表示（顶部），转录因子以黄色菱形节点表示（底部），中间蛋白/转录因子互作蛋白以蓝色椭圆表示（中间）。互作蛋白节点的大小根据其连接数（度）进行缩放。边表示转录因子、互作蛋白和激酶之间的调控/物理相互作用。红色边框的激酶通过两种推断方法独立鉴定，即转录因子相关互作蛋白的富集分析和差异丰度磷酸化蛋白的富集分析。这些重叠的候选激酶包括PRKDC、CHEK2、ATM、ATR和AURKA，是网络中突出显示的主要汇聚特征。完整网络可通过NDEx进行交互式探索，以查看单个节点和相互作用。

另见图S6。

蛋白集合 | 排名 | 激酶 | MeanRank | 重叠蛋白 | 转录因子互作蛋白
1 | PRKDC | 15.36 | 8
0 | 2 | CHEK2 | 18 | 8
0 | 3 | ATM | 18.83 | 8
7 | 4 | PLK1 | 19 | 8
0 | 5 | MAPK8 | 19.09 | 8
4 | 6 | CHEK1 | 19.73 | 7
5 | 7 | ATR | 20.45 | 7
8 | 8 | ABL1 | 21.36 | 8
1 | 9 | MAPK1 | 26.36 | 8
8 | 10 | AURKA | 29.27 | 7
5

表3 转录因子互作蛋白KEA3分析预测的前10位激酶
MeanRank：激酶在其出现的所有文库中的平均排名。加粗显示的激酶在转录因子互作蛋白分析和磷酸化蛋白质组学激酶富集分析中均被鉴定。

讨论

本研究探讨了细胞内信号网络如何响应该应引起振荡性Ca2+相关信号的截然不同的黑视蛋白刺激时间模式。通过应用频率和时间规律性不同的刺激方案，我们得以：（1）表征TNF和IL8的NF-κB相关转录响应；（2）进行与不同时间刺激方案相关的转录和磷酸化蛋白质组学响应的无偏筛选。

使用荧光素酶报告基因和RT-qPCR对NF-κB的靶向研究表明，TNF和IL8的表达在不同时间黑视蛋白刺激方案之间存在差异。尽管光刺激次数相似，但规则刺激比时间不规则范式产生了更强的TNF和IL8诱导。然而，由于在规则和不规则范式下未直接量化细胞内Ca2+动力学，这些实验并未确立累积Ca2+活性是否等价，也未将周期性本身隔离为因果变量。匹配脉冲实验进一步揭示了基因特异性的时间敏感性，TNF（而非IL8）在两种刺激方案之间存在显著差异。刺激1小时后的RNA测序揭示了一个MYC相关的转录特征，这一发现得到了GSEA和ChEA3分析的支持。加和模型鉴定了与快速对比慢速刺激相关的更广泛转录差异，而交互作用模型鉴定了一个更严格的子集，其响应取决于黑视蛋白表达。在1小时时，78个基因显示出显著的交互作用效应，其中23个基因与加和模型差异表达基因（DEGs）重叠。因此，我们将交互作用模型基因解释为黑视蛋白依赖性时间刺激方案响应的高置信度候选者，而更广泛的加和模型特征则更谨慎地解释为与刺激相关。MYC是一种bHLH-LZ转录因子，调控控制增殖和凋亡的基因网络，其失调是许多癌症（包括HeLa细胞来源的宫颈癌）的病理基础。尽管MYC mRNA水平在慢速和快速黑视蛋白刺激之间未发生改变，但其下游转录网络受到差异调控：在更广泛的加和模型转录特征中，215个DEGs中有116个是潜在的MYC靶基因。这提出了振荡信号可能通过转录后机制影响MYC相关转录程序的可能性。

相比之下，12小时刺激产生的差异表达基因较少。由于未在整个12小时刺激期间量化黑视蛋白诱发信号的持续存在性，该后期时间点无法区分下游生物适应与所施加信号方案的改变或退化，因此仅作描述性解读。

对时间模式化刺激的转录响应产生于相互连接的信号通路中，其中包括激酶介导的蛋白质磷酸化。为探索与所观察响应相关的候选激酶网络，我们使用无标记质谱法测量磷酸化肽段丰度并进行了激酶富集分析。鉴于PCA分离相对有限以及使用了缺失值插补，磷酸化蛋白质组学发现应主要被解释为假设生成和推断性的。与此同时，我们分析了RNA测序的差异表达基因以预测上游转录因子及其互作蛋白，并使用这些预测推断上游激酶。值得注意的是，这两种推断策略中排名靠前的激酶显示了大量重叠（比较每种方法的前10位时重叠率为50%）。在我们分析中推断的激酶——PRKDC、CHEK2、ATM、ATR和AURKA中，一个统一特征是它们在DNA损伤应答和细胞周期检查点控制中的核心作用。这些通路在复制应激条件下保护基因组完整性，从而维持细胞增殖。ATM在DNA双链断裂及其他DNA完整性威胁下被经典激活，并磷酸化包括CHEK2在内的关键蛋白，以抑制细胞周期进程或诱导凋亡。PRKDC与ATM属于同一磷脂酰肌醇-3-激酶相关激酶超家族，参与DNA双链断裂的修复。值得注意的是，其中几种激酶与MYC生物学相关联。MYC过表达癌症中增殖失调和基因组不稳定性被ATM所对抗，且实验性过表达可激活ATM DNA损伤应答通路。同样，在MYC过表达的人肺成纤维细胞中抑制PRKDC是致死的。这种汇聚表明，时间模式化的黑视蛋白诱发信号可能与与MYC相关转录程序有关的应激应答和检查点网络存在交叉。尽管ATM、PRKDC和CHEK2不是经典的Ca2+依赖性激酶，但越来越多的证据表明ATM活性影响Ca2+处理，包括线粒体Ca2+摄取。由于PRKDC和CHEK2在ATM相关的DNA损伤信号网络下游发挥作用，它们在我们分析中的富集将这些通路确定为在时间模式化黑视蛋白信号背景下进行进一步研究的候选目标。

我们的发现可与先前直接控制细胞内Ca2+波形参数的研究相结合来考虑。Hannanta-Anan和Chow使用基于黑视蛋白的刺激表征了具有可控峰值幅度和占空比的Ca2+波形，发现NFAT转录活性更强烈地依赖于累积Ca2+负荷而非频率。在本研究中，实验控制的变量是在完整的Gq偶联信号网络内黑视蛋白激活的时间模式。规则、不规则和匹配脉冲刺激范式产生了不同的下游转录响应，但产生的细胞内Ca2+波形在定量上未进行匹配。因此，我们的数据并未将Ca2+频率、累积Ca2+活性或周期性隔离为独立的因果变量。相反，它们证明了不同时间模式的黑视蛋白诱发信号之间的下游响应存在差异。

总之，我们的研究利用光遗传学、RNA测序和磷酸化蛋白质组学，鉴定了与不同时间模式的黑视蛋白刺激相关的广泛转录和磷酸化蛋白质组学响应。我们提供了证据表明NF-κB相关靶基因的响应在不同时间黑视蛋白刺激模式之间存在差异，并鉴定了MYC相关的转录响应以及涉及PRKDC、CHEK2和ATM的候选应激应答和检查点相关激酶网络。这些发现为进一步研究时间信号动态如何塑造细胞决策（包括信号整合、增殖和应激应答）奠定了基础。

研究局限性

本研究存在若干局限性需要承认。首先，我们的方法依赖于时间控制的光遗传学激活黑视蛋白，这在完整的Gq偶联信号网络内诱发了重复性的Ca2+响应。由于未对所有刺激范式下的细胞内Ca2+波形进行定量表征，本实验无法确定Ca2+事件频率、响应概率、恢复、占空比或整合Ca2+活性各自对观察到的下游响应的贡献。

黑视蛋白是一种与Gαq偶联的受体，因此能激活多条下游信号分支，包括磷脂酶C激活、二酰甘油生成、PKC激活以及潜在的MEK/ERK信号传导。因此，黑视蛋白的刺激预期会在多个信号节点上产生协调一致的振荡性活动，而非单纯的Ca2?信号。先前的研究表明，PKC活性可与Ca2?信号同相位振荡并参与转录调控，包括NF-κB的激活。因此，我们的发现应被解读为在完整的Gq偶联网络内对黑视蛋白诱发的信号进行时间解码，而非作为单独解码Ca2?振荡频率的证据。其次，我们采用的是HeLa细胞，一种非兴奋性癌瘤来源的细胞系。Ca2?信号工具箱在不同细胞类型间存在显著差异，神经元和发育环境尤其具有专门的Ca2?处理机制；向兴奋性或组织特异性环境的推广性仍有待确立。第三，无标记质谱的使用降低了磷酸肽检测的灵敏度，可能会低估参与所观察到的刺激相关反应的蛋白数量。最后，由于实验的复杂性，我们未直接量化光诱Ca2?振荡在较长刺激持续时间内的稳定性，这可能导致后期时间点上转录差异减弱。

与此相关的是，Lewis实验室此前的研究采用储库耗竭策略产生重复性Ca2?振荡，同时上游受体信号极少，为分离Ca2?依赖的解码机制提供了特别干净的框架。相比之下，我们的受体基础方法有意保留受体近端的信号复杂性，在与Ca2?动力学并行的情况下激活多条下游通路。虽然这引入了额外的通路激活，但使我们能够分析在完整信号网络中，时间模式化的黑视蛋白信号如何与相互连接的激酶和转录电路相关联。因此，这些方法是互补的，解决了频率编码问题的不同层次。

资源可用性

主要联系人

有关更多信息和资源的请求应发给主要联系人Erik Smedler，并由其履行（[e-mail]）。

材料可用性

本研究中生成的稳定表达黑视蛋白的HeLa细胞群体以及pLVX-OPN4-IRES-mCherry表达构建体，在提出合理请求并完成材料转让协议后，可从主要联系人处获取。

数据和代码可用性

- 批量RNA测序数据已存于NCBI基因表达综汇数据库，并自发表之日起公开可用，登录号为GSE319210。
- 蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据已通过PRIDE库存于蛋白质交换联盟，并自发表之日起公开可用，登录号为PXD074676。
- 本研究中生成的转录因子-基因调控网络已存于网络数据交换平台，并公开可用。网络标识符如下：
- TF_Gene_Regulatory_Network_1h（NDEx UUID：5d50323d-ef7a-11ef-b81d-005056ae3c32）：https://www.ndexbio.org/viewer/networks/5d50323d-ef7a-11ef-b81d-005056ae3c32
- TF_Gene_Regulatory_Network_12h（NDEx UUID：14c37626-f062-11ef-b81d-005056ae3c32）：https://www.ndexbio.org/viewer/networks/14c37626-f062-11ef-b81d-005056ae3c32
- 本研究中生成的表达-激酶调控网络已存于网络数据交换平台，并公开可用：
- Expression-Kinases调控网络（NDEx UUID：d4c54cc9-7dc3-11f0-a218-005056ae3c32）：https://www.ndexbio.org/viewer/networks/d4c54cc9-7dc3-11f0-a218-005056ae3c32
- 用于钙成像分析、转录组分析和磷酸蛋白质组分析的特制MATLAB和R脚本公开可用，地址为GitHub：https://github.com/smedler-lab/melanopsin-paper
- 重新分析本论文所报告数据所需的其他任何信息，可在请求后从主要联系人处获取。

致谢

我们感谢Dmitry Usoskin博士和Sten Linnarsson博士此前开发的在本项目中使用的基于TTL的控制系统；感谢Ye Haifeng博士慷慨提供pIRES2-OPN4AI质粒；以及感谢Amit Zeisel博士、Anna Johnsson博士和Marcela Ferella博士在RNA测序方面给予的宝贵帮助。蛋白质组分析由Carina Palmberg和Alexey Chernobrovkin博士在卡罗林斯卡大学医学与牙科科学院的蛋白质组学中心（PK/KI）进行，以及在大哥尔摩大学萨格勒伦斯卡学院的蛋白质组学核心设施中进行，并得到SciLifeLab和BioMS的资金支持。本工作得到瑞典研究委员会（ES：2022-02185，PU：2021-03108及2025-01020）、瑞典癌症协会（授予P.U.，编号25 4957）、Lindaeus 林奈发育生物学再生医学中心（DBRM）、Knut和Alice Wallenberg基金会（E.S.：哥德堡大学Wallenberg分子与转化医学中心；P.U.：CLICK及研究助理）、卡罗林斯卡研究所KID博士研究生项目（ES）、?ke Wiberg基金会（P.U.和E.S.）、Magnus Bergvall基金会（P.U.和E.S.）以及Fredrik和Ingrid Thurings基金会（P.U.和E.S.）的支持。

作者贡献

构思与设计：E.S.和P.U.；方法学：E.S.、P.N.、M.V.-G.和P.U.；调查研究：E.S.、P.N.、M.V.-G.和J.T.；正式分析：E.S.、P.N.、M.V.-G.和J.T.；数据整理：E.S.、P.N.、M.V.-G.和J.T.；可视化：E.S.和P.N.；原稿撰写：E.S.和P.N.；审阅与编辑：E.S.、P.N.、M.V.-G.、J.T.和P.U.；监督指导：E.S.和P.U.；资金获取：E.S.和P.U.；项目管理：E.S.和P.U.

利益声明

作者声明无利益冲突。

稿件制备过程中生成式AI及AI辅助技术的使用声明

在本手稿准备过程中，作者使用了生成式AI工具（包括ChatGPT和OpenAI）协助语言编辑和文本润色。所有借助AI辅助生成的内容均经作者严格审阅、编辑和核实，作者对已发表工作的准确性、原创性和完整性负全部责任。

STAR★方法

关键资源表

试剂或资源 | 来源 | 标识符
细菌和病毒菌株 | 表达OPN4-IRES-mCherry的慢病毒 | 本文 | N/A
| 表达空载体（pLVX-IRES-mCherry）的慢病毒 | 本文 | N/A
化学试剂、多肽和重组蛋白 | 全反式视黄醛 | Sigma-Aldrich | Cat# R2500
| U73122 | Sigma-Aldrich | Cat# U67562-A
| PB | Sigma-Aldrich | Cat# D9754
| SC-514 | Sigma-Aldrich | Cat# SML0557
| Ro 106-9920 | Sigma-Aldrich | Cat# 557550
| Fura-2 AM | Thermo Fisher / Molecular Probes | Cat# F1221

关键商业试剂

RNeasy试剂盒 | Qiagen | Cat# 74104
RT2第一链合成试剂盒 | Qiagen | Cat# 330401
RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix | Qiagen | Cat# 330513
双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | Cat# E1910
Pierce TiO2磷酸肽富集与纯化试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 88301
用于流式细胞术的死细胞凋亡检测试剂盒（含Annexin V） | Thermo Fisher Scientific | Cat# V13242

存档数据

批量RNA测序数据 | NCBI基因表达综汇数据库 | GSE319210
蛋白质组学和磷酸蛋白质组学数据 | 蛋白质交换/PRIDE | PXD074676
转录因子-基因调控网络（1小时） | NDEx平台 | https://www.ndexbio.org/viewer/networks/5d50323d-ef7a-11ef-b81d-005056ae3c32
转录因子-基因调控网络（12小时） | NDEx平台 | https://www.ndexbio.org/viewer/networks/14c37626-f062-11ef-b81d-005056ae3c32
表达-激酶调控网络 | NDEx平台 | https://www.ndexbio.org/viewer/networks/d4c54cc9-7dc3-11f0-a218-005056ae3c32
特制MATLAB和R分析脚本 | GitHub | https://github.com/smedler-lab/melanopsin-paper

实验模型：细胞系

人：HeLa黑视蛋白高表达稳定细胞系 | 本文 | N/A
人：HeLa黑视蛋白低表达稳定细胞系 | 本文 | N/A
人：HeLa空载体稳定细胞系 | 本文 | N/A
人：HeLa细胞 | ATCC | CCL-2
人：293FT细胞 | Thermo Fisher Scientific | Cat# R70007

寡核苷酸

BAX引物 | 本文 | 见STAR方法
BCL2引物 | 本文 | 见STAR方法
CCND1引物 | 本文 | 见STAR方法
FGF8引物 | 本文 | 见STAR方法
GAPDH引物 | 本文 | 见STAR方法
IL8引物 | 本文 | 见STAR方法
MYC引物 | 本文 | 见STAR方法
OPN4引物 | 本文 | 见STAR方法
TNF引物 | 本文 | 见STAR方法

重组DNA

pLVX-IRES-mCherry | Clontech | 631237
pIRES2-OPN4AI | Ye等人 | 原始文献
pLVX-Melanopsin-IRES-mCherry | 本文 | N/A
psPAX2包装质粒 | Addgene | 质粒#12260
pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 质粒#12259

软件与算法

DESeq2 | Love等人 | https://bioconductor.org/packages/DESeq2
g:Profiler | Kolberg等人 | https://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gost
ChEA3 | Keenan等人 | https://maayanlab.cloud/chea3/
fgsea | Korotkevich等人 | https://bioconductor.org/packages/fgsea
KEA3 | Kuleshov等人 | https://maayanlab.cloud/kea3
missForest | Stekhoven和Buhlmann | https://cran.r-project.org/web/packages/missForest/index.html
Proteome Discoverer 3.0 | Thermo Fisher Scientific | N/A
limma | Ritchie等人 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/limma.html
Cytoscape | Shannon等人 | https://cytoscape.org/
ggplot2 | Wickham | https://ggplot2.tidyverse.org/
biomaRt | Durinck等人 | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/biomaRt.html
BioGRID | Oughtred等人 | https://thebiogrid.org/

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实验模型与研究参与者详细信息

本研究使用了人HeLa细胞（ATCC，CCL-2）和293FT细胞（Thermo Fisher Scientific，Cat# R70007）。HeLa细胞是一种来源于31岁女性患者的永生化宫颈癌细胞系。293FT细胞是HEK293细胞系的衍生株，后者来源于女性胎儿的人胚肾细胞，随后经改造以稳定表达SV40大T抗原。293FT细胞专门用于慢病毒生产，而所有光遗传学、成像、分子、转录组和蛋白质组学实验均在HeLa衍生的稳定细胞系中进行。细胞在37°C、含5% CO?的加湿培养箱中维持，并培养于补充有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。细胞按标准细胞培养程序常规传代。本研究未独立鉴定细胞系。细胞培养物经Eurofins检测支原体污染，确认为阴性。对于光遗传学刺激实验，HeLa细胞在刺激前一天以每孔100,000个细胞接种于六孔板中，并在有或无全反式视黄醛（100 nM）的条件下培养，如指示所示。本研究未使用人类受试者、原代人样本、动物、植物或微生物。因此，无需机构审查委员会批准、知情同意和动物伦理审查。

性别作为生物学变量

所有实验均使用已建立的雌性来源的人细胞系进行。因此，无法评估性别对观察到的细胞反应的影响。研究结果反映了在雌性来源细胞模型中的反应，而性别对报告的信号、转录和磷酸蛋白质组学反应的可能影响仍有待确定。

方法细节

稳定表达黑视蛋白细胞系的建立

黑视蛋白基因（OPN4）从pIRES2-OPN4AI克隆至pLVX-IRES-mCherry表达载体（Clontech PT5061-5）中。慢病毒颗粒在293FT细胞中通过共转染pLVX-Melanopsin-IRES-mCherry或空载体pLVX-IRES-mCherry与包装质粒psPAX2（Addgene #12260）和包膜质粒pMD2.G（Addgene #12259）来生产，采用磷酸钙转染法。收集病毒上清，通过超速离心浓缩，并在存在polybrene的情况下用于转导HeLa细胞。通过流式细胞分选（BD FACSAria III）分选黑视蛋白表达细胞和空载体对照细胞。通过RT-qPCR和流式细胞术（BD FACSCanto II）验证稳定表达。

光刺激

使用以下组件组装了自制光刺激装置：一个蓝色（470 nm）Rebel LED，预装在10 mm方形底座上（Luxeon Star LEDs，MR-B0030-10S），使用预切的热敏胶带（Luxeon Star LEDs，LXT-R-10）连接至25 mm方形×10 mm高alpha散热器（Luxeon Star LEDs，LPD25-10B）。光线通过Carclo 18.4度透镜（Luxeon Star LEDs，10412）聚焦。驱动电压通过连接至继电器（RS，632-089）和700 mA恒流LED驱动器（Recom，RCD-24-0.70/W）的电源（TTi，PL303QMD）施加。继电器由DAQ基于系统（Measurement Computing，USB-1208FS-PLUS）和自制软件控制。光强使用FieldMaxII-TO功率计（Coherent）测量。研究Ca2?动力学时使用5 V，长期下游研究使用4.3 V以减少光毒性。

钙成像

在37°C的正常培养基中用5 μM Fura-2/AM（Molecular Probes）加载细胞25分钟。然后，洗涤细胞并将其浸入2 mL Krebs-Ringer培养基（mM）中：119.0 NaCl、2.5 KCl、2.5 CaCl?、1.3 MgCl?、1.0 NaH?PO?、20.0 HEPES（pH 7.4）和11.0葡萄糖。Ca2?记录实验使用温控室（QE-1；Warner Instruments）和冷却的像增强型电荷耦合器件相机（Quant EM 512 SC，Photometrics）进行，相机安装于配备20×/1.0NA物镜（Carl Zeiss）的正置固定载物台显微镜（AxioExaminer.A1，Carl Zeiss）上。340和380 nm的激发由照明系统（DG4，Sutter Instrument）控制。MetaFluor（Molecular Devices）用于控制所有设备。Fura-2比率曲线以基线进行归一化并表达为R/R?，其中R?定义为记录最初10 s内的平均F340/F380比率，除非在响应分析中另有说明。药物以浴浸法给药。

响应分析

为了在具有缓慢基线漂移的长时间记录中稳健地估计基线，使用比率信号的时间变化基线R?(t)进行计算。具体而言，对于每个时间点t，基线定义为围绕t的±40 s窗口内R值的第10百分位数。在记录的开头和结尾，使用前向和后向填充以确保完整的基线估计长度。

钙峰检测

钙响应使用ΔR/R?进行分析。当时间t处的ΔR/R?超过相邻值时，识别局部极大值作为候选峰。候选峰根据显著性和峰间距进行筛选。显著性定义为峰振幅与围绕该峰±45 s窗口内的最小ΔR/R?之差。保留显著性大于整个曲线中位绝对偏差六倍的峰。在20 s内出现的峰通过仅保留具有更高显著性的峰进行筛选。

响应率分析

为了确定给定的光刺激是否诱发了Ca2?响应，在刺激开始后30 s的窗口内检测峰。在此窗口内检测到的峰被归类为响应。响应率计算为诱发可检测Ca2?峰的刺激比例。

峰宽分析

峰宽定义为从5 s光刺激开始到ΔR/R?回落至基线以上10%以内的时间点之间的时间。用于宽度估计的基线计算为刺激后30 s至50 s之间的平均ΔR/R?。

RT-qPCR

使用RNeasy试剂盒（Qiagen）收集RNA，并使用RT2第一链合成试剂盒（Qiagen）合成cDNA。qPCR在Applied Biosystems qPCR仪上使用RT2 SYBR Green ROX qPCR Mastermix（Qiagen）进行。分析按照ΔΔCT方法进行。所使用的引物如下。

**引物序列与熔解温度**

- **OPN4**：正向引物 CCCCTGCTCATCATCATCTTCTG（Tm 67°C）；反向引物 TGACAATCAGTGCGACCTTGGC（Tm 70°C）
- **IL8**：正向引物 ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC（Tm 61°C）；反向引物 AACCCTCTGCACCCAGTTTTC（Tm 63°C）
- **CCND1**：正向引物 TGGAGCCCGTGAAAAAGAGC（Tm 68°C）；反向引物 TCTCCTTCATCTTAGAGGCCAC（Tm 66°C）
- **FGF8**：正向引物 GACCCCTTCGCAAAGCTCAT（Tm 68°C）；反向引物 CCGTTGCTCTTGGCGATCA（Tm 68°C）
- **BAX**：正向引物 CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG（Tm 68°C）；反向引物 CCAGCCCATGATGGTTCTGAT（Tm 67°C）
- **BCL2**：正向引物 GGTGGGGTCATGTGTGTGG（Tm 69°C）；反向引物 CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC（Tm 67°C）
- **TNF**：正向引物 GAGGCCAAGCCCTGGTATG（Tm 69°C）；反向引物 CGGGCCGATTGATCTCAGC（Tm 69°C）
- **MYC**：正向引物 GGCTCCTGGCAAAAGGTCA（Tm 68°C）；反向引物 CTGCGTAGTTGTGCTGATGT（Tm 65°C）
- **GAPDH**：正向引物 ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG（Tm 65°C）；反向引物 GCCATCACGCCACAGTTTC（Tm 67°C）

预期扩增片段大小通过将引物序列与人类参考cDNA转录本（RefSeq）进行计算机模拟比对确定。分别识别每条正向引物的结合位点和每条反向引物的反向互补序列结合位点，扩增片段长度计算为这两个位置之间的核苷酸数目（包含引物本身）。以GAPDH为内参对照的OPN4 qPCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行分离。

**荧光素酶报告基因检测**

实验前24小时，使用Effectene（Qiagen）将细胞瞬时共转染携带NF-κB荧光素酶报告基因的质粒和荧光水母素质粒。此后收集细胞，使用双荧光素酶报告基因检测系统（Promega）测定荧光素酶活性。

**细胞活力检测**

使用Annexin V试剂盒（ThermoFisher）检测光刺激可能产生的毒性效应。染色后的细胞通过流式细胞术（BD FACSCanto II）进行分析。阳性对照组为使用1 μM岩藻黄素处理19小时的细胞。

**批量RNA测序**

**样品制备**

将培养在六个多孔培养皿中的细胞洗涤后，在预热的TrypLE Express（Invitrogen）中酶消化解离。随后计数并稀释至500个细胞/μL，全程置于冰上。之后，将1 μL细胞悬液与1.8 μL含磁珠的裂解液（0.09% Triton X-100、无核酸酶水、11.25 mM DTT、2.25 mM dNTP和2单位TaKaRa RNase抑制剂）混合，在37°C下孵育10分钟。准备C1磁珠（Invitrogen），使其结合C1-T1-T31。然后混合悬液并在72°C下孵育3分钟，冷却至4°C。随即加入3.6 μL逆转录混合物（0.98x SuperScript第一链缓冲液、6 mM MgCl?、0.81 M甜菜碱、无核酸酶水、1.6单位TaKaRa RNase抑制剂、18单位SuperScript II和2.04 μM C1-P1-RNA-TSO6），在42°C下孵育90分钟。然后将磁珠绑定于磁铁上，弃去上清液。加入10 μL PCR混合物（111 mM dNTP、0.48 μM C1-P1-PCR2、无核酸酶水和1x KAPA HiFi热启动预混液），重新悬浮磁珠。最后进行PCR扩增（95°C 3分钟；6个循环：98°C 20秒、62°C 4分钟、72°C 6分钟；10个循环：98°C 20秒、68°C 30秒、72°C 6分钟；8个循环：98°C 30秒、68°C 30秒、72°C 7分钟；最后72°C 10分钟），保存上清液。cDNA的浓度和质量分别使用Quant-iT检测（Invitrogen）和BioAnalyzer（Agilent Technologies）测定。

**文库制备与测序**

使用Tn5转座酶制备Illumina HiSeq2000测序文库。cDNA文库经AMPure（Beckman Coulter）清洁后，通过qPCR定量。将全部32个样品合并，在一条泳道中进行测序。

**差异基因表达分析**

使用R中的DESeq2包进行差异基因表达分析。从计数矩阵和样品元数据创建DESeqDataSet对象，设计公式为（~ 细胞类型 + 刺激），以在分析中考虑细胞类型和刺激的影响。此处的"刺激"指的是将细胞暴露于每1分钟（15 mHz）或每2分钟（8 mHz）一次的黑视蛋白激活光脉冲中1小时或12小时。进行标准化和差异表达检验后，以假发现率（FDR）阈值< 0.05确定差异表达基因（DEGs）。为评估黑视蛋白表达细胞与空对照细胞之间的频率依赖性转录应答是否存在差异，使用设计公式（~ 细胞类型 * 刺激）进行了额外的交互模型分析。使用交互对比检验每个时间点（1小时和12小时），快速与慢速黑视蛋白刺激之间的转录应答在黑视蛋白细胞与空对照细胞之间是否存在差异。

**主成分分析**

为评估样品间的整体变异性，对使用DESeq2包标准化的RNA-seq数据进行主成分分析（PCA）。选择前两个主成分（PC1和PC2），其捕获了数据中最大量的变异，用于可视化，并使用ggplot2包绘制PCA结果。为评估前几个主成分（PC1和PC2）与不同变量（细胞类型：黑视蛋白 vs. 空对照；刺激：无刺激、1小时和12小时）之间的关系，使用Kruskal-Wallis检验确定亚组间主成分是否存在显著差异。如果观察到显著差异，则使用Wilcoxon秩和检验进行事后两两比较。通过Benjamini-Hochberg方法对两两检验的p值进行多重比较校正，以控制假发现率。

**功能富集分析**

为阐明差异表达基因（DEGs）的生物学意义，使用g:Profiler（版本 e111_e.g.,58_p18_f463989d，数据库更新日期2024年1月25日）进行全面的功能富集分析。将经校正p值阈值0.05筛选的DEGs列表提交至g:Profiler，以调查基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集条目。除仅高亮驱动条目的选项外，分析使用默认参数进行。FDR< 0.05的条目被视为具有统计学显著性。使用ChIP-X富集分析3（ChEA3）算法（https://maayanlab.cloud/chea3/）预测具有统计学显著性的DEGs（校正p值< 0.05）的上游转录因子（TF）。ChEA3通过整合来自六个转录因子-靶标集合库的数据进行转录因子-靶标过表达分析，包括：GTEx共表达、ReMap ChIP-seq、Enrichr查询、ENCODE ChIP-seq、ARCHS4共表达和文献ChIP-seq。预测的转录因子根据其跨所有转录因子-靶基因库的平均排名（MeanRank）进行排序。构建的转录因子-基因调控网络使用Cytoscape可视化，并在网络数据交换（NDEx）平台上公开。

**基因集富集分析**

为调查转录组数据的-functional相关性，使用R中的fgsea包（版本1.28.0）进行基因集富集分析（GSEA）。GSEA的输入是DESeq2差异表达分析中所有基因的排序列表，按Wald检验统计量排序。该方法评估整个转录组的基因集富集情况，无需预先设定差异表达基因的阈值。分析使用来自分子签名数据库（MSigDB）的Hallmark基因集（50个基因集），从https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/human/collections.jsp#H下载为.gmt文件（访问日期：2025年1月10日）。fgsea包以默认参数运行，计算富集分数（ES）、标准化富集分数（NES）和关联p值。使用校正p值（FDR）确定统计学显著性，FDR< 0.05的基因集被认为显著富集。可视化包括显著通路的富集图，使用R中的fgsea和ggplot2包生成。

**磷酸化蛋白质组学**

**样品制备与蛋白质消化**

将细胞沉淀重新悬浮于150 μL裂解缓冲液（8 M尿素、1% SDS、50 mM Tris pH 8.5及蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche））中。通过在冰上涡旋和探针超声破碎DNA（20%振幅，5/2脉冲，40秒）进行细胞裂解。在4°C、13k rpm下离心10分钟以澄清裂解液。将澄清裂解液转移至新管中。加入DTT还原蛋白质至终浓度5 mM，在25°C孵育1小时；然后在避光条件下加入碘乙酰胺烷基化至终浓度15 mM，在25°C孵育1小时。加入10 mM DTT淬灭过量的碘乙酰胺。按4:1:3的体积比加入甲醇、氯仿和水。用一体积甲醇洗涤，再用冰冷甲醇进行第二次洗涤。洗涤步骤和离心（15k rpm，10分钟）之间保存沉淀。沉淀风干（不完全干燥）。将蛋白质沉淀溶解于8 M尿素和50 mM Tris pH 8.5中，并用等体积50 mM Tris pH 8.5稀释（终尿素浓度4 M）。加入LysC（1:50；LysC:蛋白质），在恒温振荡器中以300 rpm、24°C过夜孵育。然后加入三体积50 mM Tris pH 8.5（终尿素浓度1 M）。加入胰蛋白酶（1:75；胰蛋白酶:蛋白质），在恒温振荡器中以300 rpm、24°C孵育6小时。样品在4°C、15k rpm下离心10分钟；弃去沉淀，保存上清液。

**磷酸肽富集**

使用C18 SepPak（Waters，50 mg树脂，150 μL柱体积，5%结合容量）对样品进行去盐处理，并使用Pierce TiO?磷酸肽富集与清洁试剂盒（Thermo Scientific Pierce）富集磷酸肽。采用制造商的标准方案。

**液相色谱-串联质谱分析**

将磷酸肽注入nLC-MS/MS系统，包括Ultimate 3000 RSLCnano色谱系统和Q Exactive Plus Orbitrap质谱仪（Thermo Scientific）。肽段在自制C18柱上分离，25 cm（Silica Tip 360μm OD，75μm ID，New Objective，Woburn, MA, USA），以300 nL/min的流速在120分钟梯度下进行。梯度在115分钟内从缓冲液B的5%升至26%（2%乙腈和0.1%甲酸），然后在5分钟内升至缓冲液B的95%。流出物直接通过柱进行电喷雾进入质谱仪。在m/z 300–1650范围内以140 000分辨率采集调查MS谱图。MS/MS数据以17 500分辨率通过更高能量碰撞诱导解离（HCD）获得。

**肽段鉴定与定量**

使用Proteome Discoverer（版本3.0，Thermo Scientific）处理和分析原始文件。使用Sequest搜索引擎与SwissProt人类数据库（20361条条目，2022年5月）进行匹配，前体容差为5 ppm，碎片离子容差为0.02 Da。胰酶消化肽段接受0次漏切割。甲硫氨酸氧化和丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸磷酸化设为可变修饰，半胱氨酸羧甲酰甲基化设为固定修饰。使用Percolator进行肽段谱图匹配验证，严格FDR阈值为1%。对于无标记定量，使用Minora特征检测器，迹线长度为5分钟，S/N为1，同位素模式多重峰的最大delta RT为0.2分钟。选择Sequest HT阈值分数2用于肽段验证。仅使用唯一肽段进行相对定量，蛋白质需通过1%的蛋白质FDR。

**缺失值填补与主成分分析**

基于之前无标记蛋白质组学的比较研究报告随机森林方法填补一致优于其他流行方法，使用missForest R包（100棵树）对缺失值进行填补。为评估样品间的整体变异性，对标准化后的蛋白质和磷酸肽计数数据进行PCA。选择前两个/三个主成分（PC1、PC2和/或PC3），其解释了最大比例的变异，用于可视化，并使用ggplot2包绘制PCA结果。

**差异丰度分析**

使用R中的limma包对蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据集进行差异丰度分析。使用填补后的标准化蛋白质和磷酸肽计数数据及相关样品元数据，通过模型公式（~ 细胞类型 + 刺激）生成设计矩阵，以考虑细胞类型和刺激两者的影响。在此语境下，"刺激"指黑视蛋白激活光脉冲持续1小时，频率为每分钟一次（15 mHz）或每两分钟一次（8 mHz）。然后进行统计检验，基于FDR阈值< 0.05确定显著差异丰度蛋白质（DAPs）和差异丰度磷酸肽（DAPPs）。

**功能富集分析**

为探索DAPs的生物学相关性，使用g:Profiler（版本 e111_e.g.,58_p18_f463989d；数据库更新日期2024年1月25日）进行功能富集分析。将校正p值< 0.05的DAPs提交至g:Profiler，以鉴定富集的GO条目和KEGG通路。除仅高亮驱动条目的选项外，分析使用默认参数进行。FDR< 0.05的富集结果被视为具有统计学显著性。

**激酶富集分析**

使用激酶富集分析3（KEA3）工具（https://maayanlab.cloud/kea3/）预测与具有统计学显著性的差异丰度磷酸肽（校正p值< 0.05）相关的上游激酶。

KEA3 通过整合多种激酶-底物相互作用库（包括实验验证的数据集和计算推断的数据集），识别其已知或预测的底物在输入列表中显著富集的激酶。预测的激酶根据其所有可用库中的平均排名位置（MeanRank）进行排序。使用 biomaRt R 包检索与每个磷酸化肽段的蛋白质标识符相对应的经 HUGO 基因命名委员会（HGNC）批准的基因符号，并将其用作 KEA3 的输入。网络构建：使用 ChEA3 预测的在 1 小时刺激下富集程度最高的前十个转录因子（基于 MeanRank；见表 1 ChEA3 部分）作为输入，检索其相互作用蛋白。"转录因子相互作用蛋白"是指 BioGRID 蛋白质-蛋白质相互作用数据库（版本 4.4.248，2025 年 8 月发布；https://thebiogrid.org）中报告与给定转录因子物理相互作用的所有分子。在 BioGRID 中，搜索限定为智人类（Homo sapiens），并筛选仅保留有低通量（LTP）物理证据支持的相互作用，以保留较高置信度的相互作用。此处将相关转录因子相互作用蛋白定义为至少被前十个转录因子中两个所共享的相互作用蛋白。随后使用 KEA3 工具预测与这些相互作用蛋白相关的上游激酶。所得到的表达-激酶调控网络使用 Cytoscape 构建和可视化，并在 NDEx 平台上公开提供。定量与统计分析：除非另有说明，所有实验均使用独立生物学重复进行。各实验的统计细节，包括精确的 n 值、统计检验方法和显著性水平，均在相应的图注和结果部分中提供。N 表示样本量，指独立培养（生物学重复）。对于荧光素酶检测，萤光素酶值以海肾荧光素酶活性进行归一化，并以相对于未刺激对照条件的相对值表达。RT-qPCR 数据使用 ΔΔCT 方法以 GAPDH 为参照进行归一化。统计分析在 MATLAB（MathWorks）或 R（R 统计计算基金会）中进行。涉及多个实验组的比较采用方差分析（ANOVA），随后进行 Tukey 事后多重比较检验。对于两组比较，根据适用情况使用非配对或配对双尾 Student's t 检验。对于 RNA 测序和蛋白质组学/磷酸化蛋白质组学分析，统计检验和多重检验校正使用 DESeq2 和 limma 进行，如前所述，假发现率（FDR）校正后的 p 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。除非另有说明，数据以均值 ± SEM 表示，其中均值代表集中趋势的度量，SEM 代表离散程度的度量。除非另有规定，所有统计分析中 p < 0.05 被认为具有统计学显著性。未使用统计方法来预先确定样本量。除非另有说明，样本和实验组未进行随机化，也未应用分层程序。除非未满足预定义的技术质量控制标准，否则不将任何数据点或样本排除在分析之外。对于蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析，15 mHz 刺激条件中的一个生物学重复未通过质量控制标准，被排除在最终分析之外。因此，这些数据集的样本量范围为每个条件 n = 2–3 个生物学重复。根据实验设计和数据结构选择统计检验方法。基于实验设计和数据分布考虑所应用统计检验的假设条件。补充信息（6）下载全部 PDF（2.81 MB）文档 S1：图 S1–S6 电子表格（728.93 KB）表 S1：1 小时时快速刺激与慢速刺激方案之间鉴定出的差异表达基因，与图 4 相关 电子表格（630.36 KB）表 S2：12 小时时快速刺激与慢速刺激方案之间鉴定出的差异表达基因，与图 S5 相关 电子表格（1.85 MB）表 S3：通过相互作用模型分析鉴定出的在刺激 1 小时后表现出显著细胞类型依赖性差异的基因（比较快速刺激与慢速刺激方案） 电子表格（454.94 KB）表 S4：刺激 1 小时后黑视蛋白快速（15 mHz）刺激与慢速（8 mHz）刺激方案之间鉴定出的差异丰度蛋白，与图 6 相关 电子表格（154.46 KB）表 S5：刺激 1 小时后黑视蛋白快速（15 mHz）刺激与慢速（8 mHz）刺激方案之间鉴定出的差异丰度磷酸化肽段，与图 6 相关