《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：TOMM5-glycolysis-Mlxipl axis: A novel mechanistic insight into idiopathic pulmonary fibrosis
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特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种慢性、进行性间质性肺疾病，以不明原因的肺间质纤维化为特征，全球约有200万人受累，且发病率呈上升趋势。IPF患者肺功能呈渐进性且不可逆地恶化，最终导致呼吸衰竭和死亡。自2
特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种慢性、进行性间质性肺疾病，以不明原因的肺间质纤维化为特征，全球约有200万人受累，且发病率呈上升趋势。IPF患者肺功能呈渐进性且不可逆地恶化，最终导致呼吸衰竭和死亡。自2014年以来，吡非尼酮（pirfenidone）和尼达尼布（nintedanib）是唯一经美国食品药品监督管理局（FDA）批准、被证实能延缓IPF患者用力肺活量下降的药物。然而，尚无证据表明这些药物能阻止纤维化进展，亦未能显著延长生存期或改善生活质量。
在IPF进展过程中，肌成纤维细胞的持续活化导致细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积。ECM成分（如胶原蛋白）的异常蓄积加剧肺纤维化，最终导致肺功能严重受损。肌成纤维细胞的持续存在和活化是纤维化进展的关键驱动因素。有研究提出，肌成纤维细胞可能来源于单核细胞来源的巨噬细胞亚群。近期研究证实，在肺纤维化、肾纤维化和心脏纤维化等多种纤维化疾病中，骨髓来源的巨噬细胞可通过称为“巨噬细胞-肌成纤维细胞转化”（macrophage-to-myofibroblast transition，MMT）的过程直接分化为肌成纤维细胞。该转化以巨噬细胞标志物（如CD68或F4/80）与肌成纤维细胞标志物α-SMA的共表达为特征。MMT可能是慢性炎症进展为病理性纤维化的关键节点。尽管MMT研究主要集中于肾纤维化，但近期研究已证实MMT在肺纤维化中也发挥重要作用。该研究进一步证实MMT是肌成纤维细胞的重要来源，且MMT细胞丰度与肺纤维化严重程度呈正相关。证据还提示，靶向MMT可能为矽肺诱导的纤维化治疗提供潜在策略。
本研究旨在探索IPF进展过程中MMT相关表型的潜在发展，并评估线粒体外膜转位酶5（translocase of outer mitochondrial membrane 5，TOMM5）上调在该过程中的作用。研究结果表明，在小鼠RAW264.7巨噬细胞中靶向敲除TOMM5可显著抑制转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）刺激后的糖酵解通量。相反，TOMM5的靶向过表达导致MLX相互作用蛋白样蛋白（MLX interacting protein-like，Mlxipl）表达增加，进而增强α-SMA和I型胶原蛋白的表达。研究人员提出TOMM5-糖酵解-Mlxipl轴参与调控MMT相关表型，为IPF揭示了一种新型治疗策略。
论文解读
一、研究背景与科学问题
特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因未明的慢性进行性间质性肺疾病，全球约200万人受累，发病率持续上升。患者肺功能呈不可逆性恶化，最终导致呼吸衰竭和死亡。目前仅吡非尼酮和尼达尼布两种药物获FDA批准用于延缓IPF患者用力肺活量下降，但均无法阻止纤维化进展，亦不能显著延长生存期或改善生活质量。因此，深入阐明IPF的发病机制并寻找新的治疗靶点具有迫切的临床需求。
在IPF进展过程中，肌成纤维细胞的持续活化导致细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积，其中胶原蛋白的异常蓄积是肺功能严重受损的核心病理基础。近年研究揭示，骨髓来源的巨噬细胞可通过“巨噬细胞-肌成纤维细胞转化”（macrophage-to-myofibroblast transition，MMT）过程直接分化为肌成纤维细胞，该过程以巨噬细胞标志物（CD68或F4/80）与肌成纤维细胞标志物α-SMA的共表达为特征。MMT被认为是慢性炎症向病理性纤维化演进的关键节点。尽管MMT研究以往多聚焦于肾纤维化，新近证据已证实其在肺纤维化中同样发挥重要作用，且MMT细胞丰度与肺纤维化严重程度正相关。然而，驱动MMT的上游调控分子尚不明确。
本研究旨在探索IPF进展中MMT相关表型的出现，并评估线粒体外膜转位酶5（translocase of outer mitochondrial membrane 5，TOMM5）上调在该过程中的作用，以期揭示IPF的新型分子机制和治疗靶点。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员从南京医科大学第三附属医院获取4例IPF患者和4例非IPF患者的肺组织病理切片，IPF诊断依据ATS/ERS/JRS/ALAT委员会2011年专家共识标准，非IPF组选取肺结节术后病理为原位癌且取材距恶性结节至少2 cm的“正常”肺组织。动物实验采用8–12周龄雄性C57BL/6小鼠，通过气管内滴注博来霉素（bleomycin，BLM）建立肺纤维化模型，并利用腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）介导的shRNA实现TOMM5体内敲低。体外实验使用小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞系（CRISPR/Cas9技术构建TOMM5敲除株）和人单核细胞白血病THP-1细胞系（PMA诱导分化为巨噬细胞）。主要技术方法包括：双重免疫荧光染色检测MMT相关表型、免疫组织化学（IHC）检测蛋白表达、流式细胞术定量F4/80?α-SMA?或CD11b?α-SMA?双阳性细胞比例、qRT-PCR检测mRNA表达、Western blot检测蛋白水平、2-NBDG荧光示踪和乳酸检测评估糖酵解通量、染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）联合qPCR检测Mlxipl与靶基因启动子结合、JC-1染色评估线粒体膜电位、微计算机断层扫描（micro-CT）评估肺纤维化影像学改变。
三、研究结果
3.1 IPF患者中MMT相关表型与TOMM5上调
对IPF和非IPF患者肺组织进行CD68/α-SMA双重免疫荧光染色，结果显示IPF患者肺组织中CD68?α-SMA?双阳性细胞（MMT相关表型）明显多于非IPF患者。免疫组化检测显示TOMM5蛋白在IPF患者肺组织中显著高表达。进一步分析三个公共GEO数据库（GSE10667肺组织、GSE70866支气管肺泡灌洗液、GSE87175肺成纤维细胞），均证实IPF患者TOMM5 RNA表达较对照组显著上调。相关性分析显示，GSE10667数据集中TOMM5表达与COL1A1（r=0.598）和COL1A2（r=0.604）呈显著正相关，提示TOMM5可能参与I型胶原沉积的调控。
3.2 BLM诱导肺纤维化小鼠模型中MMT相关表型与TOMM5上调
研究人员建立BLM诱导的小鼠肺纤维化模型。BLM组小鼠出现体重显著下降和典型纤维化症状。micro-CT显示BLM组肺部出现密度增高、网格样病变和通气不均。HE和Masson三色染色显示BLM组炎症细胞浸润和胶原沉积显著增加。免疫组化显示BLM组Collagen I、α-SMA和TOMM5蛋白水平均显著升高。免疫荧光和流式细胞术均证实BLM组肺组织中F4/80?α-SMA?双阳性细胞比例显著增加，与人体组织观察结果一致。
3.3 TOMM5是TGF-β1诱导MMT相关表型所必需的
体外实验显示，10 ng/mL TGF-β1刺激RAW264.7细胞可显著上调TOMM5 mRNA和蛋白表达。利用CRISPR/Cas9构建TOMM5敲除（KO）RAW264.7细胞系后，流式细胞术显示TGF-β1显著增加F4/80?α-SMA?细胞比例，而TOMM5敲除可显著抑制该效应。qRT-PCR和Western blot显示，TGF-β1诱导的Col1a1和Acta2 mRNA以及Collagen I和α-SMA蛋白上调均被TOMM5敲除显著削弱，表明TOMM5促进MMT相关表型和肌成纤维细胞活化。
3.4 TOMM5促进TGF-β1诱导的糖酵解
2-NBDG荧光示踪和流式分析显示，TGF-β1刺激增加RAW264.7细胞葡萄糖摄取，而TOMM5敲除可显著抑制该效应。qRT-PCR检测显示TGF-β1显著上调糖酵解关键酶基因Glut1、Hif-1α、Eno1、Aldoa和Ldha的mRNA表达，TOMM5敲除可显著逆转这一上调。Western blot证实Glut1和Hif-1α蛋白水平呈现相同趋势。乳酸产量检测显示TGF-β1组乳酸生成显著增加，TOMM5敲除可显著降低乳酸水平。以上结果共同表明TOMM5缺失可缓解TGF-β1诱导的糖酵解增强。
3.5 TOMM5-糖酵解-Mlxipl轴介导MMT相关表型
慢病毒介导的TOMM5过表达显著增加Mlxipl蛋白水平，并促进Mlxipl核转位。单独过表达Mlxipl即可显著上调Col1a1和Acta2 mRNA以及Collagen I和α-SMA蛋白。相反，shRNA介导的Mlxipl敲低可显著削弱TGF-β1诱导的Collagen I和α-SMA上调。ChIP-qPCR证实Mlxipl直接结合于Col1a1和Acta2启动子区域。糖酵解抑制剂GSK2837808A（10 μM）处理可显著抑制TGF-β1诱导的MMT相关表型及Collagen I和α-SMA上调，该效应在RAW264.7细胞和人THP-1巨噬细胞中均得到验证。
3.6 糖酵解和Mlxipl是TOMM5诱导MMT相关表型的关键介导因子
TOMM5过表达显著增加Mlxipl、Collagen I和α-SMA表达并促进Mlxipl核转位，而联合GSK2837808A处理可显著削弱这些效应，证实糖酵解是TOMM5驱动Mlxipl活化的必需中间环节。在TOMM5 KO细胞中过表达Mlxipl可显著恢复α-SMA和Collagen I表达，表明Mlxipl作为TOMM5下游效应因子可独立驱动纤维化表型。
3.7 TOMM5敲低在体内减轻BLM诱导的肺纤维化和MMT相关表型
AAV-shTOMM5气管内给药可显著降低肺组织TOMM5蛋白表达。在BLM诱导的纤维化模型中，TOMM5敲低显著减少Masson三色染色显示的胶原沉积，并显著降低Collagen I、α-SMA和TOMM5的免疫组化表达。流式细胞术显示，TOMM5敲低显著降低BLM诱导的F4/80?α-SMA?细胞比例，与体外结果一致。
3.8 TOMM5敲低缓解TGF-β1诱导的线粒体功能障碍
JC-1染色显示TGF-β1刺激显著增加JC-1单体比例（线粒体膜电位去极化），而TOMM5敲低可部分逆转该效应。ROS检测显示TGF-β1倾向于降低ROS水平，TOMM5敲低单独呈升高ROS趋势，但差异未达统计学显著。Western blot显示TGF-β1显著增加衰老相关蛋白p16表达，TOMM5敲低可显著削弱该效应，p21呈类似但非显著趋势。这些结果提示TOMM5敲低可缓解TGF-β1诱导的线粒体功能障碍。
四、讨论总结与研究结论
本研究揭示了IPF中MMT相关表型的存在，并鉴定TOMM5为该过程的关键调控因子。TGF-β1通过TOMM5依赖途径增强巨噬细胞糖酵解通量，进而激活葡萄糖响应性转录因子Mlxipl，Mlxipl通过直接结合Col1a1和Acta2启动子区域上调α-SMA和I型胶原蛋白表达，从而促进MMT相关表型。研究提出TOMM5-糖酵解-Mlxipl轴作为IPF的新型治疗靶点。
讨论部分指出，既往研究显示TOMM5敲除小鼠自发形成类似隐源性机化性肺炎（cryptogenic organizing pneumonia，COP）的肺纤维化病变，与本研究在纤维化条件下部分敲低TOMM5的保护效应看似矛盾。研究人员提出TOMM5可能具有双相作用：早期上调可能具有代偿性，而持续升高则促进促纤维化巨噬细胞表型。因此，部分降低病理状态下升高的TOMM5而非完全消除其生理基线水平，可能是更可行的治疗策略。此外，Mlxipl在肺纤维化中的上调已有报道，本研究进一步揭示其通过结合Col1a1和Acta2启动子促进纤维化的新机制。TOMM5敲低缓解TGF-β1诱导的线粒体功能障碍（线粒体膜电位恢复和ROS调节），提示TOMM5可能通过维持线粒体稳态调控糖酵解通量。
研究局限性包括：临床样本量小限制疾病严重程度或预后相关性分析；TGF-β1调控TOMM5表达的上游机制尚不明确；TOMM5广泛表达及其在线粒体蛋白导入中的作用带来安全性担忧；未进行ATP测量和RNA-seq分析。
研究结论：总之，本研究提示巨噬细胞标志物/α-SMA双阳性细胞（MMT相关表型）在IPF进展中发挥作用。研究结果表明，这一进展由TOMM5上调所促进，TOMM5随后激活促纤维化的糖酵解-Mlxipl信号通路。TOMM5-糖酵解-Mlxipl轴的发现提示了IPF的潜在治疗靶点。未来研究应致力于阐明该轴相关的综合调控网络，并在IPF体内模型中评估其治疗可行性。
