治疗性 HPV16 E7 疫苗接种联合 CD137 激动作用诱导小鼠肿瘤消退及持久免疫

《iScience》：Therapeutic HPV16 E7 vaccination with CD137 agonism induces tumor regression and durable immunity in mice

　　

亮点•ROP工程构建了以单一重组抗原形式递送重叠HPV16 E7区域的疫苗•ROP-E7诱发的CD4+和CD8+ T细胞应答强于野生型E7•ROP-E7联合4-1BB激动剂可实现完全肿瘤消退及超过100天的无瘤生存•4-1BB共刺激作用增加肿瘤相关HEV、减少Treg并减轻T细胞耗竭摘要预防性人乳头瘤病毒（HPV）疫苗可防止新发感染，但无法治疗已建立的HPV相关病变，这凸显了靶向病毒肿瘤抗原的治疗性策略的必要性。我们开发了一种重组重叠肽基HPV16 E7疫苗（ROP-E7），并在C57BL/6小鼠中评估了其单独或与CD137（4-1BB）激动剂联合使用的免疫原性和抗肿瘤活性。在无肿瘤小鼠中，ROP-E7诱发的辅助和细胞毒性T细胞应答强于野生型E7。在携带肿瘤的小鼠中，ROP-E7降低了肿瘤负荷并改善了生存，而联合治疗则诱导了完全肿瘤消退并实现超过100天的无瘤生存。这些效应与肿瘤内细胞毒性T细胞增加以及调节性T细胞和耗竭T细胞群减少相关。这些发现为在HPV相关癌症中联合使用治疗性HPV16 E7疫苗与T细胞共刺激提供了临床前支持。图形摘要引言高危型人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染是宫颈癌及其他肛生殖道恶性肿瘤的主要病因，其中HPV16和HPV18约占宫颈癌病例的70%。尽管预防性疫苗靶向L1衣壳蛋白，可诱导强大的中和抗体应答并防止新发感染，但对已建立的HPV相关病变或恶性肿瘤患者无治疗获益。目前尚无治疗性疫苗获批用于癌前病变患者或HPV阳性癌症患者。尽管针对HPV致癌蛋白E6和E7的临床前和临床试验显示了令人鼓舞的结果，特别是那些利用细胞介导免疫的疫苗，但治疗性疫苗方案仍存在挑战。基于DNA编码癌蛋白的疫苗能够激活细胞介导免疫，但由于E6和E7在肿瘤发生中的关键作用而存在潜在风险。野生型蛋白基疫苗交叉呈递效率有限，而表位基疫苗仅限于HLA匹配的患者。随后开发的重叠合成肽（OSP）和长合成肽（LSP）疫苗展现了令人鼓舞的免疫原性和临床活性。通过使用非致癌的重叠肽片段而非全长蛋白，基于OSP或LSP的疫苗降低了递送完整病毒癌基因相关的风险。尽管具有这些优势，肽库基方法仍存在实际和免疫学上的局限性。混合物中的单个肽可能被抗原呈递细胞（APCs）差异加工，导致表位呈递不均匀。某些单个肽在进入APC和结合MHC分子方面效率有限。此外，多种肽的合成和质量控制带来的复杂性和监管负担进一步加剧了这一问题。为克服这些挑战，我们开发了重组重叠肽（ROP）疫苗平台。该平台通过遗传连接跨越全长野生型蛋白序列的重叠肽片段，构建为单一重组构建体。肽片段之间额外的LRMK连接序列可能进一步促进蛋白水解加工并增强在不同HLA背景下肽向MHC分子的装载。重要的是，以统一蛋白底物的形式递送抗原确保了所有抗原区域的化学计量递送，并促进了高效的细胞内加工。重组ROP蛋白经工程改造破坏了致癌功能所关键的构象结构域，同时保留了T细胞表位。这一策略创造了新抗原样特征，增强了免疫原性和安全性。在本研究中，我们描述了基于HPV16 E7的ROP疫苗（ROP-E7）的开发，并将其与野生型E7蛋白（WT-E7）的免疫原性和治疗功效进行了比较。我们进一步评估了其调节免疫因子——特别是抗PD-1单克隆抗体和抗CD137（4-1BB）激动剂单克隆抗体——的协同效应。重要的是，我们阐明了ROP-E7与4-1BB联合方案所观察到的强效抗肿瘤效应的机制。结果ROP-E7构建体的设计与计算机模拟评估我们此前已展示了基于ROP的疫苗的增强治疗潜力，这为ROP-E7构建体的设计提供了依据。我们将全长HPV16 E7序列（WT-E7，98个氨基酸）划分为35个氨基酸片段，具有10个氨基酸的重叠，并使用LRMK连接序列将其拼接为单一重组蛋白。该构型保留了野生型E7的完整氨基酸序列（图1B，下划线区域），同时以蛋白酶可及的片段形式呈现。图1 ROP-E7与WT-E7的体外免疫原性和表位预测(A) ROP-E7构建体设计示意图，源自全长HPV16 E7（WT-E7）序列。(B) WT-E7和ROP-E7的氨基酸序列。WT-E7中的CRs（CR1、CR2和CR3）标记为可能参与致癌发病机制的区域。ROP-E7与WT-E7共有的肽区域以下划线标出。功能基序以高亮显示，包括LXCXE基序（绿色）和锌结合结构域（蓝色）。重叠肽之间引入的LRMK连接序列以紫色显示。(C) T细胞表位的计算机模拟预测。使用免疫表位数据库（IEDB）分析WT-E7和ROP-E7中的肽表位（8-10个氨基酸）对小鼠MHC I类分子（H-2Db和H-2Kb）的预测结合亲和力。汇总预测评分>0.1的肽段，并显示预测表位总数。选择这些参数以最大化表位覆盖范围并促进抗原加工。选择35个氨基酸的肽长度是基于先前证据表明长肽可被专职APCs有效内化，并在呈递前需要细胞内加工。10个氨基酸的重叠确保所有潜在的CD8+ T细胞表位在相邻片段间均被保留，因为重叠长度超过了最小CD8+ T细胞表位的典型长度。因此，该重叠结构最大化地保证了E7序列中天然加工表位至少在一个片段中得到保留。为进一步增强抗原加工，相邻肽片段通过LRMK连接序列相连，该序列作为组织蛋白酶S的可切割位点，而组织蛋白酶S是专职APC中高表达的蛋白酶。在这些位点的切割促进了肽片段在内体区室内的释放，从而促进有效表位生成以装载到MHC分子上。这些设计参数以及LRMK连接序列在促进抗原加工中的功能作用已在先前ROP疫苗研究中进行了优化和实验验证。WT-E7蛋白含有多个保守区域（CRs），对其致癌活性至关重要（图1B）。N端CR1和CR2结构域参与细胞转化，包含结合视网膜母细胞瘤（pRb）家族肿瘤抑制蛋白所需的LXCXE基序（绿色高亮）。C端CR3结构域含有锌结合基序（蓝色高亮），支持结构稳定性和二聚化，两者均为完全致癌功能所必需。重要的是，这些活性依赖于全长E7蛋白的三级结构和细胞内表达。相比之下，ROP-E7作为外源重组蛋白递送，而非DNA编码抗原。被APCs摄取后，ROP-E7在内体和溶酶体区室中经历蛋白水解加工，产生短肽片段，随后装载到MHC分子上呈递给T细胞。由于这些肽被快速加工为缺乏高级结构构象的短线性表位，E7致癌活性所需的结构域（包括pRb结合和锌依赖的二聚化）无法重建。因此，抗原加工途径保留了免疫原性表位，同时消除了致癌功能所需的结构背景。为评估该构建体的免疫原性潜力，我们使用计算机模拟表位预测对ROP-E7和WT-E7进行了比较。使用免疫表位数据库（IEDB）评估8至10个氨基酸肽对小鼠MHC I类分子（H-2Kb和H-2Db）的预测结合亲和力。仅纳入预测结合评分高于0.1的肽段（图1C）。分析表明，ROP-E7构建体可能产生比WT-E7更广泛的潜在T细胞表位。这一预测模式与我们先前使用存活素基ROP疫苗（ROP-SVN）的观察一致，其相对于野生型对照表现出增强的免疫原性。尽管这些计算分析并未直接评估体内表位使用情况，但它们表明ROP设计在保留和潜在扩展抗原加工和呈递可用表位库方面的理论能力。ROP-E7在体内激活E7特异性CD4+和CD8+ T细胞应答为确定ROP-E7在体内的免疫原性潜力，C57BL/6小鼠以单磷酸脂质A（MPLA）佐剂制剂皮下接种ROP-E7或WT-E7，间隔14天（图2A）。最后一次免疫后两周，收集脾细胞和血清进行免疫学分析。WT-E7作为体外再刺激抗原，因为目的是评估疫苗接种是否产生了能够识别天然HPV16 E7肿瘤抗原的记忆T细胞应答。由于TC-1肿瘤细胞表达天然E7而非ROP-E7，使用WT-E7再刺激提供了对疫苗诱导的抗肿瘤免疫的生物学相关性评估。图2 ROP-E7诱导强烈的E7特异性T细胞应答和细胞毒性活性(A) 细胞免疫评估的疫苗接种方案。C57BL/6小鼠（每组n=10）以14天间隔接受三次MPLA佐剂ROP-E7或WT-E7皮下免疫。对照组接受MPLA或PBS。小鼠在最后一次免疫后两周处死。(B) 抗原特异性T细胞应答定量。分离单个核脾细胞并用WT-E7蛋白体外再刺激，通过ELISPOT定量释放IFN-γ的细胞。结果以斑点形成细胞（SFCs）表示。(C和D) T细胞亚群胞内细胞因子染色。单个核脾细胞用WT-E7蛋白再刺激过夜，通过流式细胞术分析。CD3+群中CD4+（C）和CD8+（D）T细胞内IFN-γ+细胞频率。(E) E7特异性CD8+ T细胞扩增。靶向HPV16 E7免疫优势表位RAHYNIVTF的MHC I类四聚体阳性CD8+ T细胞的流式细胞术分析，表示为总CD8+ T细胞的百分比。(F) 体外细胞毒性实验的疫苗接种方案。小鼠以7天间隔免疫，最后一次注射后一周收集单个核脾细胞。(G) 体外细胞毒性实验。单个核脾细胞与表达HPV16 E7的TC-1细胞以所示效应细胞:靶细胞（E:T）比例共培养48小时。通过结晶紫染色定量肿瘤细胞杀伤。除另有说明外，数据代表n=3独立生物学重复的平均值±标准误。流式细胞术门控策略描述于STAR方法中，代表性图谱见图S1和S2。统计分析使用单因素ANOVA及Tukey多重比较检验。*p<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001。ROP-E7疫苗接种诱导了比WT-E7显著更强的细胞免疫应答，以体外使用纯化的WT-E7蛋白再刺激后释放干扰素-γ的细胞频率增加为证（图2B）。流式细胞术分析进一步揭示，与接受WT-E7的小鼠相比，ROP-E7免疫小鼠中激活的CD4+和CD8+ T细胞比例更高（图2C和2D），表明T细胞激活增强。为进一步评估抗原特异性CD8+ T细胞应答，进行了靶向H-2Db限制性HPV16 E7免疫优势表位RAHYNIVTF的MHC I类四聚体染色。该分析显示ROP-E7组中E7特异性CD8+ T细胞扩增更大（图2E），与细胞毒性T淋巴细胞的增强启动和克隆扩增一致。尽管这些实验展示了ROP-E7疫苗接种后E7特异性T细胞应答的增强幅度，但它们并不能直接解决所识别表位的多样性问题。需要使用肽水平刺激的额外分析来确定ROP平台是否扩展了T细胞特异性库。为评估治疗潜力，单独队列以7天间隔进行免疫（图2F）。最后一次给药后7天，脾细胞与表达HPV16 E7的TC-1肿瘤细胞共培养。ROP-E7免疫小鼠的脾细胞显示出比对照组明显更强的肿瘤细胞裂解（图2G），证明细胞毒性效应活性增强。ROP-E7接种在早期治疗TC-1模型中改善肿瘤控制为评估ROP-E7在体内的治疗功效，我们在C57BL/6小鼠中采用TC-1肿瘤模型。小鼠在第0天皮下接种2×10^5个TC-1细胞，第5天开始疫苗接种（图3A）。此时，肿瘤通常尚不可触及或仅有轻微可触及，尽管肿瘤已建立定植且未治疗的动物中肿瘤呈进行性生长。因此，本研究评估了ROP-E7在早期治疗环境中的功效，而非在携带大体积已建立肿瘤的小鼠中。小鼠接受三次每周一次的MPLA乳剂ROP-E7或WT-E7皮下注射。PBS和单独MPLA作为阴性对照。图3 ROP-E7抑制肿瘤生长、延长生存并重塑肿瘤微环境(A) TC-1肿瘤模型中的治疗性疫苗接种策略。

C57BL/6小鼠（每组n = 10）在第0天皮下接种2 × 10^5个TC-1细胞。从第5天起，小鼠每周接受一次MPLA佐剂处理的ROP-E7或WT-E7皮下免疫接种，共3次。对照组分别接受MPLA或PBS处理。持续监测肿瘤生长情况。（B）各组间肿瘤生长动力学。（C）荷瘤小鼠的Kaplan-Meier生存分析。（D和E）肿瘤转录组的免疫细胞反卷积分析。基于bulk RNA测序数据，利用mMCP-Counter（D）和DCQ（E）算法推断的免疫细胞群组成的热图。（F–H）肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的流式细胞术分析。肿瘤中靶向HPV16 E7免疫优势表位RAHYNIVTF的MHC I类四聚体阳性CD8+ T细胞在CD8+ T细胞中的频率（F），以及肿瘤中（G）和脾脏中（H）的CD4+CD25+CD127-调节性T细胞（Tregs）频率。除非另有说明，数据表示为n = 3个独立生物学重复的平均值 ± SEM。流式细胞术设门策略见STAR方法部分，代表性图谱见附图S3和S4。生存差异采用log rank（Mantel-Cox）检验分析。??p < 0.01，????p < 0.0001。

在PBS和MPLA对照组中，肿瘤快速进展，到第22天时体积达到约1,500 mm3（图3B）。接种WT-E7或ROP-E7均可抑制肿瘤生长并改善生存，优于对照组（图3B和3C）。接受WT-E7处理的小鼠肿瘤生长减缓，平均肿瘤体积约为700 mm3，而接受ROP-E7处理的小鼠肿瘤体积更小（<500 mm3）。同样，两种疫苗处理组的生存期均较对照组延长。尽管ROP-E7组与WT-E7组之间在肿瘤生长和生存方面的差异未达统计学显著性，但ROP-E7组在整个研究期间 consistently 表现出更低的肿瘤负荷和更好的生存结果。虽然仅凭这些终点尚无法正式确立ROP-E7优于WT-E7，但观察到的趋势与ROP-E7引发的增强抗原特异性免疫应答（图2）一致，因此促使我们进一步研究肿瘤免疫微环境。

ROP-E7增强CD8+肿瘤浸润淋巴细胞和效应记忆特征，同时调节调节性T细胞

为探究ROP-E7疫苗接种如何影响肿瘤微环境，我们利用两种免疫反卷积算法——小鼠微环境细胞群计数器（mMCP-counter）和数字细胞定量（DCQ）——分析了肿瘤组织的bulk RNA-测序数据。这些方法通过定量谱系特异性基因表达特征，从bulk转录组数据中估算免疫和基质细胞群的相对丰度（图3D和3E）。

小鼠微环境细胞群（mMCP）-counter分析揭示了各治疗组间不同的免疫转录模式。与PBS对照组相比，WT-E7和ROP-E7处理小鼠的肿瘤均表现出与T细胞和CD8+ T细胞相关的增强特征，与疫苗诱导的免疫浸润一致。ROP-E7组中这些特征更为显著，提示其T细胞相关的免疫激活更强。相反，WT-E7疫苗接种小鼠肿瘤中的B细胞特征相对较高，表明两种疫苗构建体在引发的免疫组成方面存在差异。PBS处理小鼠的肿瘤表现出相对较高的基质特征，包括内皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞，与其较少的免疫炎症性肿瘤微环境一致。

为进一步检查淋巴细胞亚群，进行了数字细胞定量（DCQ）分析。ROP-E7免疫小鼠的肿瘤表现出与CD8+效应记忆和CD8+记忆T细胞相关的更强转录特征，而WT-E7疫苗接种小鼠的肿瘤则显示出与CD4+记忆T细胞和调节性T细胞（Tregs）对应的相对较高特征。

这些转录组模式得到了肿瘤浸润淋巴细胞流式细胞术分析的支持。与WT-E7处理小鼠的肿瘤相比，ROP-E7处理小鼠肿瘤中的CD8+四聚体+ T细胞显著增多（图3F）。相反，ROP-E7组肿瘤内调节性T细胞（CD4+CD25+CD127-）呈减少趋势，但该差异未达统计学显著性（图3G）。脾脏中Treg频率未发生变化（图3H），表明免疫调节主要局限于肿瘤微环境内。

综上所述，这些发现表明ROP-E7疫苗接种与增强的CD8+ T细胞相关免疫特征及抗原特异性CD8+ T细胞肿瘤浸润增加相关，同时伴随肿瘤内调节性T细胞特征减少的趋势。肿瘤免疫景观的这些变化与ROP-E7引发的增强细胞免疫应答一致，可能有助于解释相对于WT-E7所观察到的肿瘤控制改善趋势。

ROP-E7与4-1BB激动作用协同实现完全肿瘤清除

鉴于ROP-E7具有良好的免疫原性且避免了完整的天然HPV16 E7癌蛋白，我们选择ROP-E7与免疫调节剂联用进行进一步评估。

T细胞耗竭是获得持久抗肿瘤免疫的主要障碍。为确定检查点调节是否能增强ROP-E7介导的肿瘤控制，我们在TC-1肿瘤模型中评估了与抗PD-1或4-1BB激动性抗体联用的组合策略（图4A）。

图4 ROP-E7与4-1BB激动作用联合治疗增强抗肿瘤疗效

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（A）TC-1荷瘤小鼠联合治疗的治疗方案。小鼠（每组n = 10）在第0天接种2 × 10^5个TC-1细胞。从第5天起，小鼠每周接受4次MPLA佐剂处理的ROP-E7皮下注射和/或腹膜腔内注射抗PD-1或4-1BB激动性抗体（每3天给药一次）。对照组接受单药治疗或溶媒。

（B和C）抗PD-1联合治疗评估。ROP-E7单独使用或联合抗PD-1后的肿瘤生长（B）和生存（C）。

（D和E）4-1BB激动剂联合治疗评估。ROP-E7单独使用或联合4-1BB激动剂后的肿瘤生长（D）和生存（E）。

（F和G）联合治疗下肿瘤转录组的免疫细胞反卷积分析。利用mMCP-Counter（F）和DCQ（G）推断的免疫细胞群组成热图。

（H）基因集富集分析（GSEA）显示联合治疗后肿瘤相关高内皮小静脉（TA-HEV）特征富集。

（I）各组间T细胞相关基因表达特征的热图。

（J）GSEA显示联合治疗和4-1BB单药组相对于单独ROP-E7组T细胞耗竭特征减少。数据表示为平均值 ± SEM。生存差异采用log rank（Mantel-Cox）检验分析。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。

在短期内（肿瘤挑战后25天），接受PBS、MPLA或抗PD-1单药治疗的小鼠表现出肿瘤快速进展和较差的生存（图4B和4C）。相反，ROP-E7单药治疗显著抑制肿瘤生长并延长生存，证实其治疗有效性。在本研究使用的给药方案和治疗时间表下，联合抗PD-1并未较单独ROP-E7进一步改善肿瘤控制（图4B）。既往在TC-1模型中的研究报告，联合PD-1阻断可增强疫苗疗效。抗体剂量的差异以及，更重要的是，PD-1抑制相对于疫苗初次免疫的时间点差异可能是造成这些不一致的原因。在本研究中，抗PD-1与首次疫苗接种同时给药。鉴于PD-1信号通路参与早期CD8+ T细胞活化、克隆扩增和分化，在初次免疫阶段阻断PD-1可能改变效应应答的幅度或动力学。与此概念一致，PD-1缺失背景下已报告T细胞应答减弱，强调了优化检查点阻断的重要性。因此，在本实验条件下，ROP-E7单药治疗已实现了显著的肿瘤控制，而同时阻断PD-1并未提供额外获益。

相反，ROP-E7与4-1BB激动作用联合使用相较于单药治疗呈现肿瘤生长控制改善的趋势，且大多数治疗小鼠实现了完全肿瘤清除（图4D）。该联合方案相较于任一单药治疗呈现生存延长的趋势（图4E）。这些发现与既往研究一致，表明4-1BB共刺激可在某些模型中增强治疗性疫苗接种的疗效。总体而言，这些结果提示4-1BB信号可能在HPV驱动的肿瘤模型中增强ROP-E7诱导的抗肿瘤免疫。

ROP-E7与4-1BB联合治疗与肿瘤微环境中增强免疫激活及减少调节性和耗竭性T细胞特征相关

为探究联合策略增强疗效的机制，我们利用上述相同的反卷积方法（mMCP-counter和DCQ）分析了肿瘤RNA-seq数据，这些方法通过谱系特异性转录特征估算免疫和基质细胞群（图4F和4G）。mMCP-counter分析表明，ROP-E7单药和联合组小鼠的肿瘤均表现出相似水平的与T细胞和CD8+ T细胞相关的升高转录特征，提示疫苗接种是T细胞浸润肿瘤微环境的主要驱动力。

尽管总体T细胞特征相当，DCQ分析显示T细胞亚群特征存在差异。ROP-E7处理小鼠的肿瘤表现出与CD8+记忆T细胞相关的特征，而联合组则显示出与CD8+效应记忆T细胞和B细胞对应的增强特征。相反，4-1BB单药治疗与相对较高的CD4+记忆T细胞和调节性T细胞（Tregs）特征相关。值得注意的是，联合组显示与Treg相关的特征减少，提示肿瘤微环境向免疫抑制性更低的方向转变。

除免疫细胞特征外，联合治疗还与与血管重塑一致的转录变化相关。由于4-1BB既表达于活化T细胞也表达于内皮细胞（在其中可促进淋巴细胞向肿瘤迁移），我们检查了肿瘤相关高内皮小静脉（TA-HEVs）的标志物。联合治疗增加了TA-HEV相关基因表达（图4H）。TA-HEVs是已知的促进淋巴细胞外渗进入肿瘤的结构。

转录组分析还显示，联合治疗后调节性和耗竭相关基因特征减少（图4I和4J）。与此观察一致，流式细胞术分析显示，联合组肿瘤浸润的CD8+ T细胞耗竭标志物PD-1和LAG-3的表达水平低于ROP-E7单药治疗组（附图S5B）。这些发现与既往报道一致，表明4-1BB激动作用可增强T细胞功能并重新激活抗肿瘤免疫应答。

总体而言，这些结果表明ROP-E7疫苗接种联合4-1BB激动作用促进肿瘤微环境中协调的免疫应答，其特征包括效应相关T细胞特征、增强的淋巴细胞募集以及减少的调节和耗竭相关信号。这些免疫变化与联合治疗观察到的强效抗肿瘤疗效一致。

联合治疗后抗肿瘤免疫的持续性

为评估ROP-E7联合疗法诱导的抗肿瘤反应的持久性，我们对小鼠进行了长达98天的监测（图5A和5B）。在图4所示的早期实验中，肿瘤生长仅分析至第23天，提供了治疗有效性的初步评估。然而，更长的随访时间揭示了各组之间显著的差异。

图5 联合治疗诱导可召回但非完全保护性的长期抗肿瘤免疫

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（A和B）各组个体肿瘤生长曲线（A）和肿瘤生长动力学（B），观察期延长至肿瘤接种后98天，显示联合治疗小鼠的持久肿瘤消退。

（C）延长观察期的Kaplan-Meier生存曲线。

（D）再挑战和治疗策略。4只无瘤小鼠（10只存活者中4只）在第98天再次接种2 × 10^5个TC-1细胞，5天后开始第二个疗程的联合治疗。

（E）再挑战后的肿瘤生长，显示肿瘤控制表现各异以及治疗后抗肿瘤应答的部分恢复。

（F）体外召回应答分析的实验设计。6只无瘤小鼠随机分为两组（每组n = 3），其中一组接受单次ROP-E7加强免疫接种。加强免疫后7天收集脾细胞。

（G）体外细胞毒杀伤实验的代表性显微照片。加强免疫和未加强免疫小鼠的脾细胞与TC-1细胞在不同效应细胞与靶细胞比值下共培养。比例尺，50 μm。数据表示为平均值 ± SEM。统计分析采用单因素ANOVA联合Tukey多重比较检验。?p < 0.05，??p < 0.01，???p < 0.001，????p < 0.0001。

ROP-E7单药治疗最初控制了肿瘤生长，部分小鼠观察到肿瘤消退。然而，这些应答并非持久的，所有动物最终均出现肿瘤复发，导致观察期结束时0/15只小鼠实现完全缓解（图5A）。相反，ROP-E7与抗4-1BB联合使用产生了持续的肿瘤控制，15只小鼠中10只实现了完全肿瘤消退，并在整个研究期间保持无瘤状态（图5B和5C）。

因此，单药组与联合组之间的分离随时间推移而逐渐增大，导致长期肿瘤控制和生存率出现显著差异。为进一步评估抗肿瘤免疫的持续性，我们在第98天用TC-1细胞对联合组中四只无瘤小鼠进行了再次接种（图5D）。再次接种后，小鼠被监测22天以评估免疫保护的持久性。至第120天，一只小鼠（combo-3）保持无瘤状态，而三只小鼠（combo-1、combo-2和combo-4）发生肿瘤复发（图5E）。其中，combo-1表现出快速肿瘤生长，而combo-2和combo-4的肿瘤进展较为缓慢。这些发现表明，长期抗肿瘤免疫记忆在一定程度上得以保留，但不足以均匀地防止肿瘤复发。为确定残余免疫反应能否被重新激活，我们于第123天对再次接种的小鼠进行了第二轮联合方案治疗（图5D）。值得注意的是，在此时间点，combo-1、combo-2和combo-4中的复发肿瘤已被允许发展并可被检测出来。虽然快速生长病例（combo-1）中的肿瘤进展未得到控制，但combo-2和combo-4中的肿瘤生长受到抑制，并使这些小鼠实现肿瘤清除（图5E）。这些结果表明，联合方案诱导的抗肿瘤免疫可在肿瘤复发时被重新激活，并且在三只已建立复发肿瘤的小鼠中的两只小鼠中，足以介导肿瘤消退。为进一步探讨这一点，来自图5D的六只肿瘤排斥小鼠被分为两组，其中一组接受单剂ROP-E7加强免疫（图5F）。七天后，收集脾单核细胞并以不同效应细胞与靶细胞比例与TC-1细胞共培养。通过结晶紫染色法测定的细胞毒性显示，加强免疫组存在肿瘤杀伤作用，而非加强免疫组小鼠的脾细胞则表现出极低的细胞毒性活性（图5G）。这些结果表明，肿瘤特异性细胞免疫在肿瘤清除后得以持续，但需要抗原再刺激才能恢复强效的细胞毒性活性。

**讨论**

在本研究中，我们开发了一种靶向HPV16 E7的ROP疫苗，并在HPV相关肿瘤模型中评估了其免疫原性和抗肿瘤活性。与野生型E7（WT-E7）相比，ROP-E7可能在保留广泛序列覆盖的同时，在体内诱导了强烈的CD4+和CD8+ T细胞应答。这些应答与肿瘤内淋巴细胞浸润增加和肿瘤生长受抑相关。将ROP-E7疫苗接种与4-1BB激动相结合进一步增强了抗肿瘤免疫，表现为肿瘤相关高内皮微静脉（TA-HEVs）增加、调节性T细胞（Treg）特征减弱以及T细胞耗竭减轻。综上所述，这些发现支持将基于ROP的抗原工程作为治疗性HPV疫苗的一种策略，并为将疫苗介导的T细胞启动与共刺激免疫治疗相结合提供了理论依据。

有效的HPV靶向治疗性疫苗需要在安全性、免疫原性和抗肿瘤活性之间取得适当平衡。HPV癌蛋白E6和E7是公认的肿瘤相关病毒抗原，已被广泛研究作为治疗性疫苗靶点。然而，它们固有的致癌功能需要谨慎对待，尤其是在涉及原病毒蛋白的长期表达或载体介导表达的策略中。ROP-E7构建体的设计旨在保留E7序列覆盖，同时破坏天然蛋白结构，从而提供一种工程化抗原形式，在不施用完整天然E7的情况下诱导E7特异性免疫。与LSP方法相比，重组ROP构建体可能还通过在一个重组产品中纳入多个重叠抗原区域，而非需要单独合成的肽混合物，来简化抗原生产。

ROP-E7的免疫原性还可能受到构建体中纳入的连接序列的影响。在ROP设计中，LRMK基序主要旨在提供一个组织蛋白酶S（Cat S）敏感的蛋白酶切割位点。这些连接区域的切割预计有助于将重组蛋白加工为更短的抗原片段，通常在约15–30个氨基酸范围内，随后可被抗原呈递细胞（APCs）更有效地加工和呈递。LRMK相关的Ii-Key序列此前已被报道在与肽抗原连接时可增强抗原呈递并促进T细胞应答。这一已报道的免疫调节特性可能为ROP-E7的免疫原性提供额外贡献。需要直接的机制研究来确定连接序列介导的蛋白酶加工与LRMK序列的任何额外免疫刺激效应各自的相对贡献。

ROP-E7疫苗接种增加了肿瘤浸润的CD8+ T细胞，并与瘤内调节性T细胞群减少的趋势相关。转录组分析进一步显示，ROP-E7处理后T细胞相关免疫特征富集。这些发现表明，ROP-E7疫苗接种不仅诱导系统性抗原特异性T细胞应答，还促进肿瘤微环境内的免疫变化。这些效应对治疗性疫苗接种至关重要，因为有效的抗肿瘤免疫既需要产生肿瘤特异性淋巴细胞，也需要它们在肿瘤组织中的招募和活性。

虽然ROP-E7单药治疗抑制了肿瘤生长，但在部分小鼠中发生了肿瘤复发，表明疫苗诱导的免疫单独不足以在所有动物中维持肿瘤控制。肿瘤微环境内的免疫抑制通路可能导致这种不完全应答。靶向PD-1/PD-L1轴的免疫检查点阻断已显著推进了癌症免疫治疗。然而，在本研究评估的条件下，将ROP-E7与抗PD-1治疗相结合并未比单独使用ROP-E7改善抗肿瘤活性。这一结果可能反映了与本研究中之前研究相比抗体剂量或治疗方案的差异，也可能表明在该肿瘤模型中T细胞功能障碍涉及额外的抑制性或共刺激通路。

因此，我们评估了4-1BB（CD137）共刺激作为增强疫苗诱导抗肿瘤免疫的替代策略。4-1BB是一种促进T细胞增殖、存活和效应功能的共刺激受体。虽然系统性4-1BB激动剂已显示出显著的免疫刺激活性，但其临床开发受限于剂量依赖性毒性，特别是肝毒性。在本研究中，作为单药使用的较低剂量的4-1BB激动抗体抗肿瘤活性有限，但与ROP-E7疫苗接种联合时增强了肿瘤控制。联合方案使接受治疗的小鼠实现肿瘤完全消退，并延长了无瘤生存期。这些发现与一种模型一致，即疫苗介导的启动扩增肿瘤特异性T细胞，这些T细胞随后可通过4-1BB响应共刺激放大信号。

目前正在探索的改善4-1BB靶向治疗治疗窗的方法包括Fc修饰或无Fc抗体、双特异性分子以及旨在将4-1BB信号限制在肿瘤微环境内的肿瘤局部激活策略。在我们的研究中，联合治疗在实验期间未伴随显著的体重下降（图S5A）。虽然这一观察本身不足以确立全身安全性，但它支持进一步调查疫苗介导的T细胞启动是否能在较低抗体剂量下实现有效的4-1BB共刺激。

转录组分析为与联合治疗相关的免疫变化提供了额外见解。ROP-E7联合4-1BB激动增强了T细胞相关免疫应答，促进了与TA-HEV形成相关的淋巴细胞浸润，并减少了与耗竭T细胞群相关的特征。由于TA-HEVs可促进淋巴细胞进入肿瘤，且与免疫活性肿瘤微环境及免疫治疗应答相关，这些发现为联合治疗观察到的增强抗肿瘤活性提供了潜在的机制基础。伴随的CD8+ T细胞浸润变化以及CD8+ T细胞与Treg的平衡也可能作为ROP治疗性疫苗未来研究中药效学指标的价值。

除4-1BB共刺激外，ROP-E7还可与已建立的癌症治疗方法联合评估，包括手术、放疗和其他免疫治疗策略。此外，替代的疫苗递送技术可能进一步增强抗原摄取和呈递。例如，纳米盘疫苗已被报道可改善抗原递送和交叉呈递，并可能与ROP平台的抗原工程特性互补。

肿瘤再次接种实验提供了证据，表明ROP-E7疫苗接种可以产生免疫学记忆，尽管动物间的保护程度存在差异。部分小鼠在再次接种后维持肿瘤控制，而其他小鼠在缺乏进一步免疫的情况下发生肿瘤。重要的是，加强免疫恢复了肿瘤特异性细胞毒性，表明功能性记忆应答得以持续，并可在抗原再暴露后被重新激活。这些发现表明，优化疫苗接种方案和外递送系统对于改善ROP-E7诱导的抗肿瘤免疫的持久性可能至关重要。

重组ROP形式也可能相比施用短外源肽提供免疫学优势。短肽可直接与表面MHC分子结合，但通常对内源性抗原加工通路的可及性有限。相比之下，交叉呈递通常需要抗原摄取后进行胞内加工。因此，重组ROP抗原可能在APCs内经历内化和蛋白酶加工，从而能够通过MHC II类和交叉呈递通路持续产生抗原肽用于呈递。Cat S敏感连接序列的存在可能通过促进重组抗原裂解为适当大小的片段来进一步促进这一加工过程。这一特性可能有助于ROP-E7疫苗接种后观察到的CD4+和CD8+ T细胞应答的诱导。

除HPV相关恶性肿瘤外，ROP抗原工程策略在治疗性疫苗开发中可能具有更广泛的应用。通过在重组构建体中保留广泛的抗原序列覆盖，该平台可以促多表位T细胞表位呈递，同时避免生产复杂的单个合成肽混合物。这一设计原则可能可以适应其他病毒或肿瘤相关抗原，尽管其免疫原性和治疗活性需要对每个靶点分别进行评估。

总之，ROP-E7在临床前HPV相关肿瘤模型中诱导了HPV16 E7特异性细胞免疫，促进了T细胞向肿瘤浸润，并抑制了肿瘤生长。其抗肿瘤活性经4-1BB共刺激后显著增强，这与肿瘤免疫微环境的更广泛重塑以及接受治疗的小鼠中持久的肿瘤控制相关。这些发现为ROP治疗性疫苗的进一步评估提供了临床前支持，包括优化抗原递送和剂量、评估长期免疫记忆以及研究合理的免疫调节疗法联合方案。

**研究局限性**

本研究存在若干局限性应予考虑。首先，ROP-E7的免疫原性和抗肿瘤活性——无论是单独使用还是与4-1BB激动联合——是在小鼠HPV相关肿瘤模型中评估的。虽然该模型能够在体内对疫苗诱导的抗肿瘤免疫进行受控评估，但无法完全复现人类HPV相关恶性肿瘤的生物学、免疫学和临床异质性。因此，在确立该方法的转化潜力之前，需要在额外的临床前模型和人类来源系统中进行验证。

其次，4-1BB激动的安全性评估有限。治疗期间未出现显著体重下降提供了耐受性的初步指示，但不能排除全身性或器官特异性毒性。鉴于肝毒性一直是系统性4-1BB激动剂的主要关注点，未来的研究应包括血清生化检测、组织病理学评估以及对炎症和肝毒性的评价，以更好地界定联合方案的治疗窗。

第三，T细胞表位识别的广度是根据计算MHC结合预测推断的，而非通过肽水平的功能实验直接确立的。虽然ROP-E7疫苗接种诱导的抗原特异性T细胞应答强于WT-E7，但现有数据无法确定这种增强是否反映了对更广泛表位库的识别，还是对少数优势免疫表位的更强应答。此外，使用重组抗原的脾细胞再刺激实验测量了整体抗原特异性应答，而未分辨单个表位特异性。因此，需要肽库筛选、肽水平再刺激和实验性表位定位来确定ROP-E7诱导的T细胞应答的广度和层级。

第四，ROP构建体免疫原性增强的机制未得到直接确立。特别是，连接序列（包括LRMK基序）对接原摄取、加工和呈递的预期贡献仍有待实验证明。需要比较含有修饰或删除连接序列的ROP构建体的研究，结合抗原加工和MHC呈递的直接分析，来确定其机制贡献。

最后，在没有额外免疫的情况下，对肿瘤再次接种的持久保护未得到一致维持。虽然加强免疫恢复了抗肿瘤应答，但这些发现表明，保护性免疫记忆的量或持久性可能需要进一步优化。

未来研究应确定ROP-E7诱导的记忆性T细胞表型、功能和 longevity（长寿性/存活时间），并评估替代疫苗接种方案、佐剂或递送平台是否能改善长期保护性免疫。

**资源可用性**

**主要联系人**
有关进一步信息和资源请求应联系主要联系人 Sisheng Jiang（[e-mail]），并将由其满足。

**材料可用性**
本研究生成的重组 ROP-E7 和 WT-E7 表达构建体可通过合理请求向主要联系人获取。

**数据和代码可用性**
- 本研究中从小鼠肿瘤样本产生的 bulk RNA 测序数据已存入 NCBI 基因表达综合数据库（GEO），在登录号 GSE347031 下公开可用。存档的数据集包括原始测序数据、处理后的表达数据和相关样本元数据。访问这些数据不需要物质转移协议（MTA）、机构授权或其他限制。
- 支持本研究结论的所有其他处理后数据均已在本文及其补充信息中提供。本研究未报告原始软件代码。用于 RNA 测序分析的脚本已在 GitHub 公开可用，网址为 https://github.com/HeleneZhao/HPV16_E7/。重新分析本文报告数据所需的任何其他信息可通过合理请求向主要联系人获取。

**致谢**
感谢 Oxford Academy 的 Yingli Zeng（曾英丽）协助图表注释。本研究由英国牛津大学肿瘤学系 OVM/CBI 研究基金支持。

**作者贡献**
概念化：Y.O.、W.L. 和 S.J.；方法学：Y.O.、W.L.、H.Z.、C.D.、Q. Zheng、L.Z.、Y.J. 和 Q. Zhang；数据获取：Y.O.、H.Z.、C.D.、W.L.、Q. Zhang 和 Q. Zheng；数据分析：Y.O.、W.L.、H.Z.、C.D. 和 Q. Zhang；稿件撰写和审阅：所有作者。

**利益声明**
S. Jiang 是开发癌症疫苗的 Oxford Vacmedix Ltd 公司的股东。其余作者声明无潜在利益冲突。

**稿件准备过程中生成式 AI 和 AI 辅助技术的声明**
在本作品准备过程中，第一作者使用 ChatGPT 改进了段落和句子流畅度。作者根据需要审阅和编辑了输出内容，并对发表文章的内容承担全部责任。

**STAR★ 方法**

**关键资源表**

| 试剂或资源 | 来源 | 标识符 |
|---|---|---|
| **抗体** | | |
| 小鼠 Fc 受体封闭剂 | Thermo Fisher Scientific | Cat# 14–0161-82; RRID: AB_467133 |
| 抗小鼠 CD3 | BioLegend | Cat# 100213; RRID: AB_493644 |
| 抗小鼠 CD4 | BioLegend | Cat# 100405; RRID: AB_312690 |
| 抗小鼠 CD8a | BioLegend | Cat# 162305; RRID: AB_2927947 |
| 抗小鼠 IFN-γ | BioLegend | Cat# 505807; RRID: AB_315401 |
| 抗小鼠 CD25 | BioLegend | Cat# 102011; RRID: AB_312860 |
| 抗小鼠 CD127 | BioLegend | Cat# 135010; RRID: AB_1937251 |
| 抗小鼠 PD-1 | BioLegend | Cat# 135205; RRID: AB_1877232 |
| 抗小鼠 LAG-3 | BioLegend | Cat# 125211; RRID: AB_2561516 |
| 抗小鼠 PD-1（克隆 RMP1-14） | InVivoMab | Cat# BE0146; RRID: AB_10949053 |
| 抗小鼠 4-1BB（克隆 3H3） | InVivoMab | Cat# BE0239; RRID: AB_2687721 |
| HPV16 E7 特异性 MHC I 类四聚体 | MBL | Cat# TS-5008-1C |
| **细菌和病毒菌株** | | |
| 大肠杆菌 BL21(DE3) 感受态细胞 | New England Biolabs | Cat# C2530H |
| **化学品、肽和重组蛋白** | | |
| ROP-E7 重组蛋白 | 本文 | N/A |
| WT-E7 重组蛋白 | 本文 | N/A |
| MPLA 佐剂 | Sigma-Aldrich | Cat# S6322 |
| 卡那霉素 | Sigma-Aldrich | Cat# 60615 |
| IPTG | Sigma-Aldrich | Cat# 420291 |
| Ficoll-Paque Premium 1.084 | Sigma-Aldrich | Cat# GE17-5446-02 |
| 刀豆蛋白 A | Sigma-Aldrich | Cat# C2272 |
| 胶原酶 II | Sigma-Aldrich | Cat# C1764 |
| DNase I | Sigma-Aldrich | Cat# 69182 |
| 结晶紫 | Sigma-Aldrich | Cat# C6158 |
| **关键商业检测** | | |
| 小鼠 IFN-γ ELISpot 试剂盒 | Mabtech | Cat# 3321-2A |
| 显色鲎阿米巴样变形虫裂解物（LAL）检测 | Thermo Fisher Scientific | Cat# A39552 |
| 细胞内染色通透裂洗缓冲液 | BioLegend | Cat# 421002 |
| **存档数据** | | |
| 小鼠肿瘤的 bulk RNA 测序数据 | 本文；NCBI 基因表达综合数据库 | GSE347031 |
| RNA 测序分析脚本 | 本文；GitHub | https://github.com/HeleneZhao/HPV16_E7/ |
| **实验模型：细胞系** | | |
| TC-1 小鼠肿瘤细胞系 | Biofeng Biotech | N/A |
| **实验模型：生物体/菌株** | | |
| 6 周龄雌性 C57BL/6 小鼠 | Charles River Laboratories International Inc., UK | C57BL/6J，菌株编号：632 |
| 6 周龄雌性 C57BL/6 小鼠 | Jiangsu Aniphe Biolaboratory Inc., China | C57BL/6J |
| **重组 DNA** | | |
| pNIC28-Bsa4 表达载体 | Structural Genomics Consortium, Oxford | 可从 Addgene 获取，Cat# 26103 |
| ROP-E7/pNIC28-Bsa4 重组质粒 | 本文 | N/A |
| WT-E7/pNIC28-Bsa4 重组质粒 | 本文 | N/A |
| **软件和算法** | | |
| IEDB 分析资源 | IEDB | https://www.iedb.org/ |
| NetMHCpan 4.1 EL | IEDB | 版本/方法：2023.09 |
| FlowJo | BD Biosciences | 版本：v10 |
| BaseSpace | Illumina | 版本：3.0 |
| DRAGEN RNA pipeline | Illumina | 版本：4.3 |
| R Foundation | | 版本：4.5.3 |
| sva | Bioconductor | 版本：3.22 |
| immunedeconv | R package | 版本：2.1.0 |
| mMCP-counter | R package | 版本：1.1.0 |
| ComplexHeatmap | Bioconductor | 版本：2.14.0 |
| DESeq2 | Bioconductor | 版本：1.38.3 |
| fgsea | Bioconductor | 版本：1.24.0 |
| msigdbr | R package | 版本：7.5.1 |
| GSVA | Bioconductor | 版本：7.5.1 |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | 版本：11.1.0 |
| **其他** | | |
| Attune 流式细胞仪 | Thermo Fisher Scientific | Attune NxT Flow Cytometer |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | BD LSRFortessa Cell Analyzer |
| ImmunoSpot ELISpot 读数仪 | Cellular Technology Limited | S6 Micro M2 |
| 酶标仪 | BMG Labtech | CLARIOstar Plus |

**实验模型和参与者详情**

**细胞系**
TC-1 小鼠肿瘤细胞系购自 Biofeng Biotech（中国江苏）。细胞在含有 10%（v/v）胎牛血清（FBS）的 RPMI 培养基中维持，按照制造商建议，在 37°C、含 5% CO? 的湿润环境中培养。本研究未对 TC-1 细胞系进行独立鉴定。实验使用前对细胞进行支原体污染检测，确认为无支原体污染。

**动物**
无特定病原体（SPF）6 周龄雌性 C57BL/6 小鼠购自 Charles River Laboratories International Inc.（英国）或 Jiangsu Aniphe Biolaboratory Inc.（中国）。小鼠饲养在独立通风笼中，提供筑巢材料，自由获取标准颗粒饲料和觅食材料。

在英国进行的动物实验按照英国 1986 年《动物（科学程序）法》进行，项目许可证编号 PP4558762。

在中国进行的动物实验按照机构和国家标准进行，经中国天津医科大学总医院批准，批准编号 SCXK(Jin) 2020-0017。

小鼠通过 CO? 窒息处死，随后以颈椎脱臼作为二次处死方法。

**方法细节**

**分子克隆**
编码 ROP-E7 和 WT-E7 的 cDNA 序列经密码子优化后由 GeneArt（Thermo Fisher Scientific）合成。序列被克隆入线性化的 pNIC28-Bsa4 表达载体。重组质粒按照制造商方案转化入大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞。从含卡那霉素琼脂平板上分离的单克隆用于后续蛋白表达。

**蛋白表达和纯化**
含重组 ROP-E7 或 WT-E7 表达质粒的大肠杆菌在含 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 培养基中于 37°C 过夜培养。培养物稀释至 2YT 培养基中，培养至 600 nm 波长光密度（OD600）达到约 0.6。用 0.1 mM IPTG 诱导蛋白表达，持续 6 小时。

分离含目标蛋白的包含体，进行变性和镍亲和层析纯化。纯化后的蛋白通过尿素梯度透析至含 10% 甘油的 PBS 中进行复性。

使用显色鲎阿米巴样变形虫裂解物（LAL）检测定量内毒素浓度。纯化的 ROP-E7 和 WT-E7 制剂中残余内毒素浓度均 < 1 EU/mL。

实验中，抗原制剂按 1:20 稀释用于体内给药，最终内毒素浓度约为每次 200 μL 体内注射中 0.05 EU/mL。

**免疫表位预测**
使用 IEDB 分析资源评估 WT-E7 和 ROP-E7 的 MHC 结合能力。使用 NetMHCpan 4.1 EL（2023.09）预测小鼠 MHC I 类对 H-2Kb 和 H-2Kb 的结合。分析所有可用长度的肽段。预测评分 > 0.1 的纳入结果部分呈现的摘要中。

**流式细胞术**
从脾脏或肿瘤制备单细胞悬液（具体操作依每个实验而定）。细胞转移至 V 底 96 孔板，用 MACS 染色缓冲液洗两次，重新悬浮于小鼠 Fc 受体封闭试剂中。细胞在室温下孵育 15 分钟以减少非特异性抗体结合。

表面染色时，细胞与针对 CD3、CD4、CD8a、CD25、CD127、PD-1 和 LAG-3 的指定抗体或 HPV16 E7 表位特异性 MHC I 类四聚体孵育。抗体在 MACS 染色缓冲液中稀释 1:200。表面染色后，细胞用 10% 甲醛固定。

细胞内细胞因子染色时，细胞使用细胞内染色通透裂洗缓冲液通透和洗涤，随后与 1:100 稀释的抗 IFN-γ 抗体孵育。抗体和四聚体的详细信息见关键资源表。

数据使用 Attune 流式细胞仪或 BD LSRFortessa 获取，并使用 FlowJo 软件分析。依次设门以识别单细胞（FSC-A vs FSC-H）、活细胞和指定免疫细胞群。CD8?IFN-γ? 细胞、脾 CD8? 四聚体阳性细胞、肿瘤浸润 CD8? 四聚体阳性细胞和肿瘤浸润调节性 T 细胞的代表性设门策略分别见图 S1–S4。

四聚体阳性群落的设门位置由 PBS 处理对照小鼠的四聚体染色样本指导，以建立背景染色。实验组间应用相同的设门标准。生物学重复数在相应图注中为每个实验指定。

**动物免疫和肿瘤模型**
对于初始免疫原性研究，小鼠被分配到每组 5 只动物的治疗组。ROP-E7 或 WT-E7（每只 100 μg 溶于 200 μL）与 MPLA 佐剂配制，采用三剂次、间隔 14 天的加强方案皮下注射。对照小鼠接受 PBS 或单独 MPLA 佐剂。对于评估 ROP-E7 治疗活性的研究，疫苗接种按 7 天间隔进行。

建立肿瘤小鼠模型时，第 0 天将 2 × 10? TC-1 细胞皮下植入侧腹壁。肿瘤可触及后，每 7 天间隔给予含佐剂重组蛋白（每只 100 μg）、PBS 或单独佐剂皮下注射。

如指示，以 200 μg/只、3 天间隔腹腔注射抗小鼠 PD-1 单克隆抗体或抗小鼠 4-1BB 单克隆抗体。各个实验的治疗剂量数和时机在相应图中标明。

用游标卡尺测量肿瘤尺寸，肿瘤体积计算为：肿瘤体积（mm3）= 长 × 宽2 × 0.5。

肿瘤体积超过 1,500 mm3 或肿瘤接种后 33 天时处死小鼠，除非长期研究另有指定。

**长期肿瘤再挑战研究**
对于长期疗效研究，观察期延长至初始肿瘤治疗期之外。10 只接受 ROP-E7 联合 4-1BB 激动剂治疗的小鼠在第 98 天达到肿瘤排斥。

其中 4 只小鼠在腹皮下用 2 × 10? TC-1 细胞再挑战，并从第 123 天开始接受 4 剂联合方案。达到最大允许肿瘤体积或最后一次治疗剂量后 14 天时处死小鼠。

其余 6 只肿瘤排斥小鼠用于下述长期体外细胞毒性研究。

**脾细胞分离和 IFN-γ ELISpot**
使用 Ficoll-Paque Premium 1.084 分离介质分离单核脾细胞。使用小鼠 IFN-γ ELISPOT 试剂盒按制造商方案定量抗原特异性 IFN-γ 分泌细胞。

简要而言，将 96 孔 PVDF 板用提供的捕获抗体包被，在 4°C 孵育过夜。封闭后，向每个孔加入 2.5 × 10? 单核脾细胞溶于 100 μL 培养基中。加入 5 μg/孔的 WT-E7 蛋白于 50 μL 培养基中作为刺激物。阴性对照孔不加抗原，阳性对照孔用 5 mg/mL 刀豆蛋白 A 刺激。

样本和对照按双份分析。在 37°C 孵育过夜后，洗涤板并依次与生物素标记检测抗体和链霉avidin-HRP 偶联物孵育，随后用底物显色。板用去离子水冲洗并过夜风干。使用 ImmunoSpot ELISpot 读数仪量化斑点。

**体外细胞毒性**
为评估疫苗诱导的细胞毒性活性，在最后一次免疫后 7 天分离单核脾细胞作为效应细胞。

对于长期免疫实验，在 ROP-E7 联合 4-1BB 激动剂治疗后排斥肿瘤的 6 只小鼠在第 98 天（初始肿瘤接种后）随机分为两组。第 131 天，一组接受单次皮下加强剂量 ROP-E7（每只 100 μg），另一组接受 PBS。第 138 天分离单核脾细胞。

细胞毒性检测前一天，将 TC-1 靶细胞按 5 × 103 个/孔接种至 96 孔板，在 37°C 孵育过夜。随后按 10:1 至 100:1 的效应细胞-靶细胞比例加入脾细胞效应细胞。

效应细胞和靶细胞共孵育过夜。残留黏附细胞用结晶紫染色 10 分钟，用 PBS 洗涤。用酶标仪拍摄活细胞图像。

**bulk RNA 测序样本制备**
肿瘤切下，切成约 2 mm 大小的碎片，投入液氮中速冻直至处理。

为进行免疫细胞谱分析，肿瘤样本用胶原酶 II 和 DNase I 酶解离，通过细胞过滤器生成单细胞悬液。分离单核细胞，重悬于 RPMI 培养基中，过夜孵育。非黏附细胞收集用于后续 RNA 测序。

在每个实验组内，来自多只小鼠的肿瘤样本被随机分配至两个子集。每个子集中的样本在 RNA 提取前混合。因此，每个混合样本构成由多只小鼠肿瘤组成的一个混合生物学重复。每个实验组的两个混合重复独立进行 RNA 提取、文库制备和测序。

RNA 文库制备和 bulk RNA 测序由 Genewiz/Azenta Life Science 完成。测序数据以 FASTQ 文件提供，上传至 Illumina BaseSpace，并使用 DRAGEN RNA pipeline 处理。使用 DRAGEN reference builder 生成的参考，将 reads 比对至小鼠 GRCm39 参考基因组。

**RNA 测序分析**
混合生物学重复的 RNA 测序数据整合为单一表达矩阵。FPKM 值转换为每百万转录本数（TPM）并进行 log2 转换，表示为 log2(TPM + 1)。使用 sva R 包中实现的 ComBat 算法校正批次效应。批次校正后的值在免疫细胞去卷积前转换回线性尺度。

免疫细胞去卷积使用 "immunedeconv" R 包进行。

使用"dcq"方法估算T细胞和B细胞亚群，而"mMCPcounter"用于估算更广泛的免疫细胞和基质细胞群体。各细胞类型的评分在样本间进行标准化，并使用"ComplexHeatmap" R包以热图形式展示。

在通路富集分析中，使用"DESeq2"对原始计数矩阵进行差异基因表达分析。根据log2倍数变化对基因进行排序，并使用"fgsea"进行基因集富集分析。利用"msigdbr"获取Hallmark和基因本体生物学过程基因集。由于"fgsea"使用预排序的基因列表进行富集分析，因此在富集分析前未应用倍数变化或单个基因p值阈值。通路水平的统计显著性通过Benjamini-Hochberg校正p值定义，错误发现率（FDR）< 0.05视为显著。

使用"GSVA" R包进行基因集变异分析，以生成各样本的富集评分。标准化后的富集评分以热图形式展示。

软件包及版本列于关键资源表中。

**定量与统计分析**

统计分析使用GraphPad Prism完成。各实验所使用的统计检验方法在相应图注中具体说明。涉及动物的实验中，除另有说明外，每只小鼠均视为独立的生物学重复。

对于涉及两组以上比较的情况，如指示所述，采用单因素方差分析（ANOVA）后接Tukey多重比较检验。生存分布比较采用对数秩检验（Mantel-Cox检验）。

数据以均值±标准误表示，除非另有说明。统计显著性定义为?p < 0.05；??p < 0.01；???p < 0.001；????p < 0.0001。各项比较的精确p值、相关检验统计量、自由度及独立生物学单元数量见附表S1（补充统计信息）。

对于RNA测序的通路富集分析，采用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正，错误发现率（FDR）< 0.05视为具有统计显著性。

**补充信息（1）**

PDF（1.05 MB）

文件S1。图S1–S5和表S1