《Biochimie》：Peptides derived from TsAP-2 exhibit potential antifungal activity against
Candida species and promote non-infected wound healing both
in vitro and
in vivo
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源自TsAP-2（Tityus serrulatus抗菌肽-2）的衍生肽对念珠菌属（Candida spp.）具有潜在抗真菌活性，并在体外（in vitro）和体内（in vivo）促进非感染伤口愈合。赖氨酸或精氨酸的插入确保了抗微生物活性。该类似物具有抗真菌
源自TsAP-2（Tityus serrulatus抗菌肽-2）的衍生肽对念珠菌属（Candida spp.）具有潜在抗真菌活性，并在体外（in vitro）和体内（in vivo）促进非感染伤口愈合。赖氨酸或精氨酸的插入确保了抗微生物活性。该类似物具有抗真菌和抗生物膜（antibiofilm）活性。研究人员在体外和体内观察到非感染伤口愈合活性，并在生物活性浓度下观察到良好的耐受性。
**论文解读**
**研究背景与目的**
念珠菌属（Candida spp.）真菌常以共生状态定植于口腔，但当宿主出现抗生素诱导的菌群失调或免疫抑制（如癌症、HIV）时，其定植增加，可导致口腔念珠菌病（oral candidiasis）。临床上表现为不适、疼痛和黏膜改变；若发生抗真菌耐药或治疗不当，可进展为系统性或侵袭性念珠菌病，累及血液和器官，死亡率高达40%至75%。白色念珠菌（Candida albicans）是最常见分离菌种，光滑念珠菌（C. glabrata）、热带念珠菌（C. tropicalis）和克柔念珠菌（C. krusei）等也常见。世界卫生组织（WHO）将白色念珠菌列为关键优先病原体，光滑念珠菌为高优先病原体。目前临床可用的抗真菌药仅有多烯类（polyenes）、唑类（azoles）和棘白菌素类（echinocandins）三大类，且易因生物膜形成、外排泵激活、ERG3或ERG6基因突变等机制产生耐药。因此，亟需寻找新的抗真菌候选物。
抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）是先天免疫的重要效应分子，通过破坏微生物细胞膜（如成孔）发挥作用，不易诱发耐药。先前研究通过cDNA分子克隆从巴西黄蝎（Tityus serrulatus）毒腺转录组中鉴定出AMP TsAP-2（序列FLGMIPGLIGGLISAFK-NH2，净电荷+2），其类似物TsAP-S2（净电荷+6）虽具有与TsAP-2相当的抗真菌活性，但在抑制浓度下表现出明显溶血作用。为获得抗真菌活性更强且生物相容性更好的新肽，研究人员将TsAP-2序列中的中性氨基酸替换为碱性残基（赖氨酸/精氨酸），以增加阳离子特性和疏水矩，同时保留α螺旋构象，并将C端赖氨酸替换为精氨酸。由此设计出三种类似肽TsAP-2 A33、A34和A35，并已申请专利（巴西国家工业产权局第BR 1020200031236号）。本研究旨在表征这些类似肽，通过体外实验评估其抗真菌活性、毒理学参数，以及体外和体内伤口愈合活性。
**主要技术方法**
研究人员从Aminotech公司商业合成C端酰胺化的TsAP-2 A33/A34/A35（纯度>90%）。利用HeliQuest、Porter 5.0、PepCalc.com预测理化性质；I-TASSER预测三维结构，并用Ramachandran图、MolProbity评分验证；使用HADDOCK 2.4对TsAP-2 A34和咪康唑与四个真菌靶标（β-1,3-葡聚糖合酶、δ-14-固醇还原酶、14-α-脱甲基酶、胸苷酸激酶）进行分子对接，并用GROMACS对14-α-脱甲基酶复合物进行200 ns分子动力学模拟。抗真菌活性方面，采用CLSI微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MFC），菌株包括白色念珠菌ATCC 90028、热带念珠菌ATCC 750、克柔念珠菌ATCC 6258；用结晶紫法评估对预形成混合生物膜的破坏；用生长曲线评估抑菌动力学；用山梨醇保护实验和外源麦角固醇竞争实验研究作用机制。伤口愈合方面，用L929小鼠成纤维细胞划痕实验评估细胞迁移；在雄性瑞士小鼠（来自UFRN动物设施）背部制造5 mm手术伤口，局部施用肽（1 mg/mL）观察7天。毒性评估用MTT法测L929细胞活性，并用人类AB+红细胞进行溶血实验。统计学采用单因素方差分析与Tukey事后检验。
**研究结果**
**3.1 理化与结构特性预测**：通过在线预测工具分析，三种类似肽相比天然TsAP-2，螺旋倾向增加、疏水矩升高、净表面电荷由+2升至+4至+5，且长度不变；螺旋轮投影显示两亲性螺旋，碱性残基主要分布在螺旋一侧。I-TASSER预测的三维结构主要为α螺旋，N/C端有柔性区域。结构验证显示TsAP-2 A33和A35的拉马钱德兰图允许区残基比例100%，MolProbity评分低于2.0，结构质量可靠。
**3.2 计算机模拟分析**
**3.2.1 分子对接**：利用HADDOCK将TsAP-2 A34与四个靶标对接，结果显示其HADDOCK评分均比咪康唑更负（如对β-1,3-葡聚糖合酶为?81.7 ± 21.6 kJ/mol，而咪康唑为?34.8 ± 2.2 kJ/mol），提示在计算框架下可能形成更有利的相互作用，但这类评分并非结合自由能，不能直接解释为更高亲和力。
**3.2.2 分子动力学**：对14-α-脱甲基酶（PDB 5TZ1）复合物进行200 ns模拟，TsAP-2 A34复合物的RSMD较高（0.35~0.45 nm），平均相互作用势能（IPE）为?524.99 ± 118.67 kJ/mol，比咪康唑（?213.27 ± 28.97 kJ/mol）更负；残基分解显示Phe1和Lys7贡献突出。该结果为计算描述，不表示实验结合亲和力。
**3.3 抗真菌活性**
**3.3.1 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MFC）**：通过微量稀释法测定，三种类似肽对三种念珠菌的MIC/MFC在2.5~10 μM之间。TsAP-2 A34对白色念珠菌的MIC和MFC均为2.5 μM，效果最强；TsAP-2 A33和A34对热带念珠菌MIC为2.5 μM，对克柔念珠菌MIC和MFC为5 μM。所有肽及制霉菌素均表现为杀菌活性（MFC/MIC ≤ 4）。选择性指数（SI）方面，TsAP-2 A33和A34对所有受试菌株均>1，TsAP-2 A35对白色念珠菌和热带念珠菌>1，对克柔念珠菌为0.91。
**3.3.2 对预形成念珠菌生物膜的破坏作用**：通过结晶紫染色定量，三种类似肽在5~40 μM浓度范围内均能降低预形成混合生物膜生物量；40 μM时，A33、A34、A35分别减少73.4%、71.3%、74.3%，与制霉菌素（74.9%）相当。
**3.3.3 微生物生长动力学**：在白色念珠菌ATCC 90028生长曲线中，类似肽在亚抑菌浓度（MIC/2）下无抑制效果；在MIC及以上浓度下，从处理开始至24小时均完全抑制真菌生长。
**3.3.4 真菌细胞壁和细胞膜作用机制**：在山梨醇存在下，类似肽的MIC值不变，表明其不通过破坏细胞壁发挥活性；而外源麦角固醇存在时，A33和A35的MIC从5 μM升至40 μM，A34从2.5 μM升至40 μM，与制霉菌素的表现一致，表明其抗真菌机制涉及与膜麦角固醇的相互作用。
**3.4 体外细胞迁移实验**：通过划痕实验观察L929成纤维细胞迁移，TsAP-2 A35（2和4 μM）在12小时使划痕分别缩小81.2%和83.4%，对照组为29.3%；TsAP-2 A33（4 μM）和A34（2 μM）在12小时达到100%闭合；24小时各组无显著差异。
**3.5 体内非感染手术伤口愈合活性**：在小鼠背部5 mm手术伤口模型中，每日局部施用TsAP-2 A34（1 μg/μL）或A35（1 μg/μL），7天后伤口面积分别减少84.35%和79.35%，而聚维酮碘（PVP-I）组为58.1%，说明两种肽能加速非感染伤口闭合。
**3.6 毒理学参数**
**3.6.1 细胞活性**：MTT法显示，TsAP-2 A33、A34、A35对L929细胞的CC
50分别为9.44 μM、7.46 μM和9.12 μM；A33和A35在8 μM浓度下维持80%以上细胞活性，A34约为50%，呈浓度依赖。
**3.6.2 溶血活性**：人类AB+红细胞溶血实验显示，在接近MIC的低浓度范围内，肽的溶血活性较低；TsAP-2 A35在9.375 μM时为21.59%，A33为17.79%，A34在18.75 μM时为22.92%，总体呈浓度依赖性，支持其在活性浓度下的可耐受性。
**讨论与结论**
讨论部分指出，类似肽通过增加净电荷、疏水性和两亲性，增强了对带负电真菌膜的电吸引和插入能力，从而发挥抗真菌活性。序列修饰中精氨酸/赖氨酸的空间分布影响了阳离子性和两亲性，但毒性与这些参数的关系尚无一致结论。计算机模拟提示TsAP-2 A34可能与麦角固醇生物合成酶等靶标产生相互作用，但需实验验证。与文献中其他AMP相比，该系列肽表现出“强抗真菌活性”（MIC值在3.51~25 μg/mL范围内）。抗生物膜活性优于一些已知AMP，如ToAP-2需要16×MIC才能显著减少成熟生物膜，而类似肽在MIC×8浓度即减少约70%。生长抑制特性和麦角固醇竞争结果支持其膜靶向机制。伤口愈合方面，类似肽的促愈合效果与天然TsAP-2相当。尽管AMPs存在蛋白酶稳定性差、血清蛋白结合等临床转化障碍，但通过序列优化、纳米递送系统等策略可克服，且已有多种AMP进入临床试验。
**研究结论翻译**：因此，本研究中评估的源自合理生物技术优化（旨在改善构效关系）的TsAP-2类似肽（TsAP-2 A33、TsAP-2 A34和TsAP-2 A35）表现出了作为抗真菌候选剂的治疗潜力。它们在体外具有抗真菌和抗生物膜活性，并且在大多数受试的肽-菌株组合中，在具有抗真菌活性的浓度下表现出可接受的耐受性，其选择性和程度因肽和念珠菌菌株而异。此外，TsAP-2 A34和TsAP-2 A35在非感染的体外和体内模型中显示出伤口愈合潜力。需要进一步研究这些有前景分子的体内抗真菌功效和安全性，以支持其未来的开发和治疗适用性。
