哈萨克马（Adai、Zhabe、Mugalzhar和Naiman）的De Novo基因组组装与注释

《Animals》：De Novo Genome Assemblies of Kazakh Horses: Adai, Zhabe, Mugalzhar and Naiman

　　

简单摘要：哈萨克马是哈萨克人民重要的文化遗产，在现今哈萨克斯坦领土上历经数千年塑造而成。在本研究中，研究人员对土著哈萨克马类型Adai、Zhabe、Mugalzhar和Naiman的基因组进行了研究。对个体水平上的这些哈萨克马类型（Adai、Zhabe、Mugalzhar和Naiman）进行了长读长和短读长测序。随后对基因组进行组装和注释。组装后的基因组显示出高覆盖度，Adai、Zhabe和Mugalzhar的平均contig N₅₀值为9,681,711 bp，而Naiman的contig N₅₀值达到17,090,216 bp，平均基因组长度为2,442,471,376 bp。基因注释分别在Adai、Zhabe、Mugalzhar和Naiman中鉴定出19,584、19,941、18,695和20,572个蛋白质编码基因。所得基因组数据可作为未来研究马驯化起源与分化的重要资源，提供与当前现有高质量参考基因组相当连续性的基因组组装。

摘要：哈萨克马是哈萨克人民的重要文化遗产，在现今哈萨克斯坦领土上历经数千年塑造而成。长期适应极端自然条件导致其形成了一套独特的特征，确保了这些马的高生存能力、生态可塑性和经济价值。对三个品种（Adai、Zhabe、Mugalzhar）进行了长读长和短读长测序，而Naiman仅使用纳米孔长读长（nanopore long-read）数据进行测序。所得读段被组装，随后对基因组进行注释。组装后的基因组显示出高连续性，Adai、Zhabe和Mugalzhar的平均contig N₅₀值为9.68 Mb（9,681,711 bp），而Naiman的contig N₅₀值为17.09 Mb（17,090,216 bp），平均组装长度为2.42 Gb（2,442,471,376 bp）。这些是个体参考组装，为未来的比较基因组学和泛基因组开发奠定了基础。基因注释分别在Adai、Zhabe、Mugalzhar和Naiman中产生了19,584、19,941、18,695和20,572个蛋白质编码基因。这些组装为未来的遗传分析、家马地理和品种起源研究、品种保护工作提供了补充，并将有助于正在进行的马科泛基因组工作。

马（Equus caballus）是科学研究的重要动物，约5500年前在欧亚草原被驯化。高质量参考基因组对于理解马的进化、遗传和育种具有重要价值。尽管已有多个品种的参考基因组，但哈萨克马这一独特遗传资源仍缺乏高质量的基因组组装。哈萨克马的Adai、Zhabe、Mugalzhar和Naiman等类型长期适应极端气候和饲料短缺，形成高生存能力和经济价值。因此，研究人员对这四个品种进行基因组从头组装（de novo assembly）和注释，以提供基础资源。

本研究基于每个品种一匹成年公马的血样，提取DNA。对Adai、Zhabe和Mugalzhar同时采用DNBSEQ短读长测序和Oxford Nanopore Technologies（ONT）长读长测序，对Naiman仅采用ONT长读长测序（约47×覆盖）。组装流程包括：Kmergenie估计基因组大小，Flye进行长读长组装，medaka和Pilon进行纠错，RagTag以T2T-horse1.0为参考构建染色体级支架，并使用NCBI FCS去除污染序列。重复序列用RepeatModeler2和RepeatMasker注释；基因结构用Braker2整合公共RNA-seq数据（ENA PRJEB53382）和近缘物种蛋白数据库预测；功能注释用InterProScan。这些方法产生了高连续性和高准确性的基因组。

结果：

3.1 马基因组的从头组装
混合组装平均contig N₅₀为9.68 Mb，Naiman为17.09 Mb，总长约2.42 Gb。所有组装的读段比对率超过99%，BUSCO完整度超过99.3%。与TB-T2T参考比对，约95%可定位，未定位部分主要由结构变异（structural variant）构成；Sniffles鉴定约17,000个缺失、15,000个插入、1,300个倒位和30个重复。Y染色体覆盖率93.74%–99.98%，线粒体基因组成功组装。这些结果说明长读长深度可弥补短读长缺失，仅用纳米孔测序也能获得高质量参考基因组。

3.2 基因组注释
重复序列平均占基因组的34.35%。基因预测获得18,695–20,572个蛋白质编码基因，平均约19,698个。mRNA数量（24,745–27,486）低于参考基因组，但BUSCO蛋白质模式显示完整基因占91.3%–94.0%，平均完整性93%，重复率7.4%。InterProScan分析显示至少91%的蛋白有功能结构域，RNA-seq数据显示平均94.99%的预测基因有表达支持，表明注释可靠。

讨论与结论：
讨论指出单个个体组装的局限性，未来需要群体水平测序来区分个体与群体变异。高质量Y染色体和线粒体基因组支持父系/母系谱系分析。结构变异揭示哈萨克马与参考基因组的差异。结论：四个哈萨克马品种基因组组装展示高连续性，为比较基因组学和保护工作奠定基础。虽然基于单个体，但捕获了个体水平序列和结构变异，约5%未比对到参考，主要归因于结构变异。近完整的Y染色体覆盖率（93.74%–99.98%）支持未来对中亚马驯化相关父系谱系的系统发育分析。将组装与现有马基因组整合可扩展泛基因组资源，用于研究中亚马起源、选择育种和进化分析。数据已通过NCBI SRA（BioProject PRJNA1425729）和Zenodo（DOI: 10.5281/zenodo.18681010）公开。