《Cell Biomaterials》：Brain-informed helper lipid selection enhances intracranial mRNA delivery
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合成信使RNA（mRNA）为治疗脑部疾病提供了一种瞬时、非病毒的替代方案，但向神经元和胶质细胞的递送仍因缺乏高效载体而受限。在此，研究人员引入了组织脂质组引导的辅助脂质选择策略，用于工程化脂质纳米颗粒（LNP）以实现颅内mRNA递送。通过筛选来自脑脂质组的22
合成信使RNA（mRNA）为治疗脑部疾病提供了一种瞬时、非病毒的替代方案，但向神经元和胶质细胞的递送仍因缺乏高效载体而受限。在此，研究人员引入了组织脂质组引导的辅助脂质选择策略，用于工程化脂质纳米颗粒（LNP）以实现颅内mRNA递送。通过筛选来自脑脂质组的22种辅助脂质，鉴定出N-神经酰基鞘磷脂（nSM），一种不对称长链鞘磷脂，可在神经和非神经细胞类型中将转染效率提高2至10倍。nSM增强胆固醇依赖性摄取，并通过形成多层囊泡结构促进胞质递送，该结构在内涵体样条件下具有膜融合性。颅内递送的nSM纳米颗粒将基因编辑效率较基准制剂提高3.3倍，且当负载Cre mRNA时，可诱导足够的光遗传蛋白表达，实现对小鼠行为的可逆光遗传控制。nSM纳米颗粒还能转染人干细胞来源的神经元和离体人脑组织。这些发现确立了组织信息引导的辅助脂质选择作为脑部基因递送的有效策略。
基因治疗为神经发育、精神和神经疾病提供了调节或纠正病理性神经活动的潜力，但当前基因递送主要依赖腺相关病毒（AAV），其受限于载货量小、预先存在及治疗诱导的免疫反应、制造工艺复杂，且某些转基因（如CRISPR-Cas9核酸酶）的持续表达可导致细胞毒性和脱靶效应。因此，缺乏安全、瞬时、可重复给药的非病毒递送系统是脑定向治疗的主要瓶颈。脂质纳米颗粒（LNP）可封装大尺寸多样化载荷、便于工业化放大、允许瞬时基因表达并减少长期毒性风险，通常诱导较低免疫反应而支持重复给药。然而，多数优化集中于可电离脂质和系统分布，脑内直接注射LNP的研究仍有限。脑组织脂质含量丰富且具独特区室分布，研究人员假设利用脑脂质组指导辅助脂质选择，可提升LNP的颅内mRNA递送效率。
研究人员从脑脂质组中筛选22种辅助脂质，鉴定出N-神经酰基鞘磷脂（nSM）为高效辅助脂质。nSM可增强胆固醇依赖性摄取、促进内涵体逃逸，在小鼠脑中提高CRISPR编辑3.3倍，并支持光遗传操控行为；在人多能干细胞来源神经元和离体脑组织中亦有效。该研究确立了组织脂质组指导的辅助脂质选择作为脑部基因递送的策略，为神经系统非病毒基因治疗提供了新框架。
研究方法方面，研究人员利用空间和总体脂质组数据选取22种脑来源脂质，替换标准辅助脂质1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC），以SM-102等可电离脂质制备LNP，包裹荧光素酶或绿色荧光蛋白（GFP）mRNA，在Neuro-2a（N2A）神经元、原代人星形胶质细胞和HMC3小胶质细胞中进行体外转染筛选。采用动态光散射、冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）、Laurdan广义极化（GP）和F?rster共振能量转移（FRET）等方法表征LNP理化性质。体内评估使用Ai9报告小鼠和C57BL/6J野生型小鼠，通过立体定位注射递送Cas9 mRNA和单链引导RNA（sgRNA）；在Ai32小鼠中注射Cre mRNA进行光遗传行为实验。人源验证使用诱导多能干细胞（iPSC）来源神经元和离体人胎脑组织切片，样本来源包括美国典型培养物保藏中心（ATCC）及加州大学旧金山分校获取的人胎脑组织（孕16–24周）。
研究结果如下：
脑脂质组引导的辅助脂质筛选鉴定出nSM为高效辅助脂质：通过在神经和非神经细胞类型中的发光报告筛选，发现鞘磷脂类表现最佳，其中nSM将转染效率较DSPC提高2至10倍，且在多种可电离脂质骨架和mRNA货物中均有效。
nSM LNP促进mRNA摄取和脂质融合：流式细胞术显示nSM LNP使细胞内Cy5标记mRNA积累增加近10倍，且对胆固醇依赖的抑制剂更敏感；共聚焦成像显示其与内体溶酶体标记物共定位降低。cryo-TEM显示nSM LNP更多呈多层囊泡形态，Laurdan GP显示其在生理pH下膜有序性更高、在内涵体样酸性pH下流动性增加；FRET实验显示其膜融合性增强，并出现六角相（HII）。
nSM LNP改善小鼠脑内CRISPR-Cas9编辑：在Ai9小鼠海马注射包封Cas9 mRNA和sgRNA的nSM LNP，tdTomato阳性细胞比例达16.0%±1.7%，比MC3基准高3.3倍，神经元编辑比例从21%提升至69%，且星形胶质细胞和小胶质细胞反应在2周内消退。
nSM LNP实现内源神经元基因编辑：靶向Rbfox3（NeuN）的sgRNA经nSM LNP递送，6周后NeuN阳性细胞分数下降33.7%±5.8%，而基准MC3仅下降17.3%，且空间上局限于齿状回。
nSM LNP支持光遗传控制小鼠行为：在Ai32小鼠次级运动皮质注射Cre mRNA的nSM LNP，表达光敏感通道蛋白ChR2-EYFP；473nm光刺激使运动速度从28.9增至61.7 mm/s，对侧旋转偏向从21.5%升至78.4%，对照动物无变化，且连续3天重复可靠。
nSM LNP增强人神经元mRNA递送并转染离体脑组织：在iPSC来源神经元中，nSM LNP的GFP表达高于MC3，Cas9编辑效率达72.3%；在离体人胎脑切片中，nSM LNP实现GFP表达并优于MC3。
讨论总结指出，nSM通过胆固醇依赖途径促进摄取，并通过多层结构和HII相增强内涵体逃逸，从而提升胞质mRNA递送。体内外数据表明其可提高神经元编辑效率，但Rbfox3 sgRNA存在脱靶活性，需进一步优化；人离体组织实验样本量有限，结果仅为概念验证。总体而言，该研究将辅助脂质库从DSPC/1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）扩展至脑脂质来源的nSM，为脑部非病毒基因治疗提供了新框架。研究结论可翻译为：这些发现确立了组织信息引导的辅助脂质选择作为脑部基因递送的有效策略。
