基于金纳米粒子/氧化石墨烯/MoO?-MoS?生物电极和对苯二酚/金纳米标记物的CYFRA 21-1电化学竞争性检测

《Bioelectrochemistry》：Electrochemical competitive detection of CYFRA 21-1 on a gold nanoparticles/graphene oxide/MoO 3-MoS 2 bioelectrode employing hydroquinone/gold nanotags

　　

• 金纳米颗粒/氧化石墨烯/MoO3–MoS2杂化材料实现竞争性免疫传感。
• 创新平台将生物传感与对苯二酚/金纳米标签放大技术相结合。
• CYFRA 21-1通过在传感电极上与纳米标签形成免疫复合物进行检测。
• 人血清中CYFRA 21-1的分析验证了竞争性免疫传感器的可行性。
• 新型竞争性传感平台显示出肺癌诊断的临床潜力。

**引言**

肺癌是最危险的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率极高[1], [2]。病例和死亡人数的增加在很大程度上归因于吸烟、环境污染、过量饮酒和不健康饮食[3]。它对人类健康和生活质量构成严重威胁[1]。因此，早期诊断对于降低死亡率至关重要。肺癌通常分为两种主要类型：小细胞肺癌和非小细胞肺癌（NSCLC）[2], [4]。细胞角蛋白19片段21-1（CYFRA21-1）是肺癌早期检测和临床监测的敏感且特异性的生物标志物，尤其是NSCLC[4], [5], [6], [7], [8]。它在肺癌患者的血清中显著升高，已被确定为NSCLC最敏感的生物标志物[6]。3.3 ng mL?1的阈值被广泛接受为正常人血清中CYFRA21-1的标准切点，基于良性肺部疾病中观察到的水平，具有95%的特异性[6], [7], [8], [9], [10]。血清CYFRA21-1水平与NSCLC的临床分期相关，可用于筛查和监测疾病进展[2]。相应地，CYFRA21-1检测的快速、灵敏、准确和用户友好的方法开发已引起越来越多关注[11]。现有技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[10], [12]、化学发光[13]、表面增强拉曼散射（SERS）[14]、表面等离子体共振（SPR）[15]、荧光分析[16]和聚合酶链反应（PCR）[17]。尽管这些方法具有良好的灵敏度和特异性，但它们通常需要大量样品、涉及复杂程序，并且存在分析时间长、稳定性低和成本高的问题[11], [18]。相比之下，电化学免疫传感器由于其高灵敏度、选择性、稳定性、快速响应、易用性、经济性和微型化潜力而引起了显著关注[5], [19], [20]。这些传感器利用高亲和力抗体-抗原相互作用，已成为临床诊断中的有力工具[20]。

电化学免疫测定利用特异性免疫识别结合电化学检测方法，监测抗原-抗体结合相互作用，通常使用无标记、夹心法、类夹心法或竞争性检测方法[19], [20], [21], [22]。策略主要包括固定抗体或抗原，促进精确的抗原-抗体相互作用[19], [20], [21], [22]。在竞争性免疫测定平台中，目标分析物（如抗原或蛋白质）与电极表面固定的抗原竞争结合标记抗体上的识别位点，抗体附着在带有信号分子的纳米标签颗粒上，从而减弱电信号[23], [24], [25]。产生的电化学信号与目标分析物的浓度成反比，从而实现准确的定量分析[26], [27]。此外，这种方法具有关键优势，包括高灵敏度、选择性、可重复性、稳定性、可靠性和准确性，使其非常适用于早期诊断[21], [24], [25], [28]。

在竞争性免疫传感器的设计中，选择促进抗原固定的纳米材料和用于抗体偶联的金属纳米颗粒发挥着至关重要的作用[22], [25], [29]。通常，免疫传感器的灵敏度在很大程度上取决于传感平台的电化学性能，特别是其电化学活性、活性位点密度、电子转移动力学、电导率和生物分子固定能力[23], [30]。近年来，为传感应用设计的纳米材料，包括氧化石墨烯（GO）、剥离的MoO3–MoS2和金纳米颗粒（AuNPs），已被广泛探索以增强电化学传感器的灵敏度[11], [31], [32]。GO是一种富含含氧官能团（如羧基、羰基、羟基和环氧基）的二维纳米碳材料[33], [34], [35]，提供了优异的生物相容性并促进生物分子固定。其大比表面积和有利的电子转移特性进一步支持高效的电化学性能[33], [36], [37]，同时为免疫探针附着提供丰富的活性位点[36]。二硫化钼（MoS2），属于过渡金属二硫化物家族，具有层状S–Mo–S结构，层内具有强的面内键合，层间为弱的范德华相互作用[38], [39]。这种结构提供高表面积、可调节的带隙和有利的电学性质，有助于生物传感系统中电子转移的增强[39], [40], [41]。为进一步改善其功能，溶剂辅助剥离技术已被用于高产量生产少层纳米片[42], [43]。值得注意的是，该过程中的部分氧化导致MoO3的形成，引入了额外的电活性位点，改善了表面极性并增强了催化活性，从而促进了与传感应用相关的氧化还原反应[44], [45]。在此背景下，GO与MoO3–MoS2的整合不仅提高了电导率和电子转移动力学，还提供了促进AuNPs在复合基质中均匀分散和稳定的平台。AuNPs的掺入由于其高电导率和与生物分子固定的强亲和力（包括抗体、蛋白质、酶和核酸）进一步放大了传感器性能[46], [47]。其大比表面积可实现生物分子的密集负载，而电极与氧化还原物种之间高效的电子转移增强了信号输出[48], [49], [50]。此外，AuNPs与纳米复合材料集成时表现出优异的生物相容性和结构稳定性[51], [52]。总之，AuNPs/GO/MoO3–MoS2纳米复合材料建立了结构集成且电化学生效的界面，最大化了活性位点的可及性，改善了界面电荷转移并稳定了生物识别元件，从而实现了高灵敏度的竞争性免疫传感平台。值得注意的是，在竞争性测定中，所测得的信号直接反映了抗体-抗原相互作用的量。此外，对苯二酚（HQ）作为信号分子，具有明确的氧化还原电位、快速的电子转移动力学和高响应稳定性，使其适用于免疫测定中的标记策略[53], [54]。重要的是，HQ基信号放大技术在AuNPs/GO/MoO3–MoS2传感平台中的整合尚未见报道，这突出了该竞争性方法的新颖性和潜在影响。

在本研究中，我们提出开发一种高灵敏度的竞争性电化学免疫传感器，用于检测非小细胞肺癌诊断的生物标志物CYFRA 21-1。该免疫传感电极由AuNPs/GO/MoO3-MoS2纳米复合材料构建，并结合通过金纳米标签进行信号放大。新制备的AuNPs/GO/MoO3-MoS2纳米复合材料用于修饰丝网印刷电极（SPE）的表面。该纳米复合材料提供了大比表面积、高效的电子转移、良好的电导率和有利的生物相容性。随后，将CYFRA 21-1抗原固定到修饰后的电极上，形成了CYFRA 21-1/AuNPs/GO/MoO3-MoS2修饰的SPE传感平台，用于特异性抗体识别。同时，将AuNPs与抗CYFRA 21-1抗体和对苯二酚氧化还原探针偶联，制备出纳米标签（HQ/anti-CYFRA 21-1/AuNPs）。当将未结合的HQ/anti-CYFRA 21-1/AuNPs纳米标签添加到所制备的传感器上时，形成免疫复合物，使得可以通过监测对苯二酚的电流响应来检测样品中的CYFRA 21-1抗原目标。该竞争性免疫传感器能够灵敏地检测CYFRA 21-1，提供了足够的线性动态范围和优异的检测限（LOD）。值得注意的是，该免疫传感器成功地在人血清样品中检测到了CYFRA 21-1。重要的是，所开发的免疫传感器是肺癌诊断的一种有前景的替代方案。

**小段摘要**

**化学品与材料合成**

本研究中使用的化学品和材料列于第S1部分，而材料合成描述在第S2-S5部分。

**生物电极制备与竞争性免疫测定**

方案1a展示了金纳米标签的制备步骤，详见支持信息第S5部分。CYFRA 21-1检测的电化学竞争性免疫传感器如方案1b所示构建。研究中所使用的3.0毫米工作电极经过等离子清洁器（PDC-32G）中的氧气（O?）等离子处理……

**纳米标签的表征**

HQ/anti-CYFRA 21-1/AuNPs纳米标签（即标记纳米颗粒）的表征在第S6部分说明。

**材料与修饰电极的表征**

未修饰的SPE以及用单一材料（AuNPs、GO和MoO?-MoS?）和复合材料（GO/MoO?-MoS?和AuNPs/GO/MoO?-MoS?）修饰的SPE的形貌和表面结构，最初使用SEM技术进行了表征（图1）。裸SPE表面呈现出不规则片段、表面粗糙度和多孔碳颗粒结构，类似于……

**结论**

总之，开发了一种竞争性电化学免疫传感器，用于灵敏检测与肺癌相关的生物标志物CYFRA 21-1。新的AuNPs/GO/MoO?-MoS?纳米复合材料具有大比表面积、快速电子转移和卓越生物相容性，用于修饰电极表面。纳米标签通过将AuNPs与抗CYFRA 21-1抗体偶联制备，随后与信号分子HQ混合，形成anti-CYFRA……

**CRediT作者贡献声明**

Patrawadee Yaiwong：原创草稿撰写、调查研究、形式分析、数据管理。Siriporn Anuthum：形式分析、数据管理。Panwad Chavalekvirat：形式分析、数据管理。Pawin Iamprasertkun：撰写–审阅与编辑。Jaroon Jakmunee：撰写–审阅与编辑。Kontad Ounnunkad：撰写–审阅与编辑、原创草稿撰写、可视化、验证、监督、资源、项目管理、方法论、调查研究、资金获取、形式……

**利益冲突声明**

作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

**致谢**

该研究项目还得到清迈大学（CMU）和清迈大学化学创新中心（PERCH-CIC）的支持。该研究项目由CMU基本基金2026（214495）支持，以及泰国科学研究与创新委员会（TSRI）（FRB690042/0162）支持。

Patrawadee Yaiwong|Siriporn Anuthum|Panwad Chavalekvirat|Pawin Iamprasertkun|Jaroon Jakmunee|Kontad Ounnunkad