基于共聚焦显微镜的四维生物被膜参考体系用于生物被膜结构与传感器信号的定量耦合

《Bioelectrochemistry》：CLSM-based 4D biofilm reference for quantitative coupling of biofilm structure and sensor signals

　　

研究人员提出了一种基于共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）的四维（4D）生物被膜参考体系，用于实现生物被膜结构与传感器信号的定量耦合。该参考体系能够建立定量的结构-信号模型。稳定的轴向配准支持对生物被膜进行多天监测。亚体素（subvoxel）拟合技术实现了快速的大面积高度重建。随时间变化，研究人员能够在像素级别上解析出高度（h）、荧光强度（I）和轴向过渡宽度（w）。通过逆建模（inverse modeling），研究人员可以从阻抗数据中估算出生物被膜的结构参数。

研究背景与现存问题

生物被膜（biofilm）形成于技术、医学和自然系统中的可润湿界面，并改变其性质。因此，需要开发一种仪器复杂度有限、能够对生物被膜形成进行定量、时间分辨监测的方法。诸如阻抗测量（impedimetric）、量热法（calorimetric）、pH值、氧气和氧化还原等传感模式适用于此目的。它们的长期潜力不仅在于检测生物被膜的形成，更在于提供目前只能通过更复杂的实验方法才能获得的生物被膜特性信息。因此，确定哪些特性可以从更简单的传感器信号中可靠地推断出来，对于基础生物被膜研究和实用监测系统的开发都具有重要意义。

然而，这种更广泛的潜力尚未得到充分挖掘。尽管许多传感器信号对生物被膜的形成反应灵敏，但其定量解释常常受到缺乏可直接分配给测量信号的生物学参考数据的限制。现有方法包括等效电路参数、点式校准和简化的光学目标变量。这些方法能提供有价值的定量信息，但它们本身并未提供一个通用的生物学参考，用以在整个生物被膜发育过程中系统地比较不同的传感器描述符和模型公式。因此，对于许多问题，共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或相关的光学方法仍然是必需的，尽管它们仪器要求高且不易并行化。目前缺少的是一个实验平台，该平台能将空间和时间上配准的生物被膜参考与并行记录的传感器信号直接结合。这样的平台将有助于确定哪些生物被膜特性可从更简单、可并行化的传感器信号中获得，并有助于开发和实验评估相应的结构-信号模型，包括经验性、数值化和数据驱动的方法。

本研究内容与结论

在此，研究人员引入了这样一个平台，它将基于CLSM的四维（4D）生物被膜参考与时间分辨的传感器数据耦合在一起。由于该参考的定义独立于传感器原理，因此传感器模态是可互换的。该参考提供了定量的生物被膜衍生变量，可以据此评估不同的传感器描述符和模型公式。在本研究中，电化学阻抗谱（electrochemical impedance spectroscopy, EIS）作为实验应用案例。在这个角色中，EIS被用来实验性地演示基于参考的结构-信号评估。同时，由此产生的4D生物被膜参考并不局限于传感器耦合，也可以独立地用于进一步的生物被膜相关问题。

关键技术方法

为实现该参考框架，平台将一个空间和时间上配准的CLSM生物被膜参考与时间分辨的传感器信号耦合起来。它包含三个相互关联的元素：一个热机械稳定的测量装置、轴向参考的CLSM采集以及从z-stacks重建局部生物被膜参数。具体的关键技术包括：1）热机械稳定性设计，通过在测量腔室而非周围空气体积中进行温度控制，并结合抽吸模式的流体系统，以减小热、机械和压力引起的轴向漂移；2）轴向参考策略，利用盖玻片作为稳定参考平面来校正缓慢的z轴漂移，并通过记录无菌参考周期来获取未定殖的传感器表面和盖玻片的位置；3）亚体素（subvoxel）参数测定，通过对轴向强度剖面进行一维高斯模型拟合，以超越z轴步长（10 μm）的精度确定局部界面位置，从而得到高度（h）、荧光强度（I）和轴向过渡宽度（w）三个参数。

研究结果

2.1 方法论平台概念

该平台将空间和时间配准的CLSM生物被膜参考与时间分辨的传感器信号耦合，包含三个要素：热机械稳定的测量装置、轴向参考的CLSM采集和从z-stacks重建局部生物被膜参数。由此产生的4D生物被膜参考由轴向参考的生物被膜高度h(x,y,t)、局部荧光强度I(x,y,t)和轴向过渡宽度w(x,y,t)组成。这些参数是从相同的配准图像数据中逐像素、逐时间点推导出来的，因此可以在几何和时间上分配给耦合的传感器信号。该参考独立于传感器原理，可与不同的同步传感器信号耦合。本研究使用平面叉指电极上的电化学阻抗谱（EIS）进行概念验证，在10分钟的周期内顺序采集了8个空间分离的感兴趣区域（ROI）。

2.2 实验装置与稳定性概念

对于4D参考，光学分辨率是不够的，测量几何形状必须随时间保持稳定，尤其是在轴向方向。表面敏感型传感器，特别是基于阻抗的电极，对距离变化反应强烈。因此，装置的设计旨在减少热、机械和压力引起的轴向偏移。通过在测量腔室而非周围空气中进行温度控制，峰值温度波动低于20 mK。采用盖玻片作为稳定参考平面来校正缓慢的z轴漂移，避免了使用荧光珠等外部参考标记。流体系统采用抽吸模式运行，以减少测量区的压力峰值。

2.3 CLSM采集与参考策略

在装置稳定后，采集被组织起来以保持所有z-stacks一致的空间和轴向配准。测量分为固定的ROI，每个ROI代表一个连续的图像场，并在整个时间序列中重复采集。对于每个ROI，记录两个轴向堆栈：一个包含传感器表面或生物被膜的下部堆栈，和一个包含作为轴向参考的盖玻片表面的上部堆栈。无菌参考周期记录了未定殖的传感器表面和盖玻片。长期测量周期使用相同的ROI几何结构和顺序，但在荧光模式下记录生物被膜，在反射模式下记录盖玻片。这保持了所有图像场随时间的几何可比性。

2.4 4D参考的重建与校正

从CLSM z-stacks中，重建了一个时间分辨、空间配准的生物被膜参考。处理过程校正了位置依赖的轴向偏移和时间漂移，并为每个ROI和时间点生成了参考轴向生物被膜位置的局部图谱。

2.4.1 ROI一致性与电极区域掩蔽：在分析过程中，ROI作为固定评估区域。如果只有部分ROI与传感器信号相关，则通过特定ROI的掩模进一步限制评估。

2.4.2 基于面积分数的阈值调整：为了校正因粗采样导致的细菌面积分数失真，使用高分辨率共聚焦起始采集图像来校准分割阈值，确保低分辨率时间序列采集获得相同的面积分数。

2.4.3 基于亚体素的参数测定：为克服10 μm轴向步长的限制，对每个xy位置的轴向强度剖面进行一维高斯模型拟合，以亚体素精度确定局部界面位置，从而计算出高度（h）、强度（I）和过渡宽度（w）三个参数。

总结讨论与研究结论

本文所提出的4D生物被膜参考平台，通过将基于CLSM的高分辨率结构信息与时间分辨的传感器信号（如EIS）直接耦合，填补了现有研究方法中的一个关键空白。它提供了一个独立于传感器原理的通用生物学参考，使得在整个生物被膜发育过程中，能够系统地评估不同传感器描述符和结构-信号模型的性能。该方法的可行性通过EIS实验得到了初步验证，展示了如何从阻抗数据中逆向估算生物被膜的结构参数。这一平台的建立，不仅为深入理解生物被膜结构与其物理化学信号之间的定量关系提供了强有力的工具，也为开发更简单、可并行化的生物被膜监测系统奠定了坚实的实验和数据基础。其重要意义在于，它有望减少对复杂光学成像技术的依赖，推动生物被膜研究向更实时、低成本和高通量的方向发展。