《Bioelectrochemistry》：Phototrophic carbon dioxide reduction in highly saline microbial fuel cell
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肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球范围内常见的恶性肿瘤，其发病机制复杂，肿瘤微环境中的免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用是影响肿瘤进展的关键因素之一。研究人员前期发现CD8+T细胞在肿瘤免疫监视中发挥重要作用，但其通过分泌颗
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球范围内常见的恶性肿瘤，其发病机制复杂，肿瘤微环境中的免疫细胞与肿瘤细胞的相互作用是影响肿瘤进展的关键因素之一。研究人员前期发现CD8+T细胞在肿瘤免疫监视中发挥重要作用，但其通过分泌颗粒酶B（Granzyme B, GzmB）直接作用于肿瘤细胞表面受体的非凋亡性信号通路尚不明确。本研究旨在探讨CD8+T细胞来源的GzmB是否通过切割肿瘤细胞表面的Notch1受体，进而调控HCC的恶性生物学行为。研究人员采用免疫组织化学染色、蛋白质印迹（Western blot, WB）、流式细胞术及共培养实验等研究方法，结合体外细胞功能实验和体内异种移植瘤模型，系统分析了GzmB对Notch1的切割作用及其下游信号通路的变化。研究结果表明，活化的CD8+T细胞分泌的GzmB能够特异性切割HCC细胞膜上的Notch1蛋白，产生可溶性NICD（Notch intracellular domain）片段，进而抑制Notch1下游靶基因（如Hes1、Hey1）的表达，显著降低肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并诱导肿瘤细胞凋亡。在体内实验中，过表达GzmB的CD8+T细胞过继转移可显著抑制HCC移植瘤的生长，且肿瘤组织中Notch1表达水平明显下降。本研究首次揭示了GzmB通过切割Notch1受体发挥非凋亡性抗肿瘤功能的新机制，为理解CD8+T细胞抗肿瘤免疫提供了新的视角，并为HCC的免疫治疗提供了潜在的新靶点。
研究背景与科学问题
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其发病率逐年上升。尽管手术切除、局部消融、肝移植及靶向治疗等手段不断进步，但HCC患者总体预后仍然较差，复发和转移率居高不下。近年来，免疫治疗尤其是免疫检查点抑制剂在HCC治疗中展现出一定疗效，但总体应答率有限，提示肿瘤微环境中免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用机制尚未被充分阐明。CD8+T细胞作为抗肿瘤免疫的核心效应细胞，传统观点认为其通过释放穿孔素和颗粒酶（granzymes）诱导肿瘤细胞凋亡。然而，颗粒酶B（Granzyme B, GzmB）除经典的促凋亡功能外，是否通过切割肿瘤细胞表面关键受体而发挥非凋亡性信号调控作用，目前尚缺乏系统研究。Notch信号通路在多种恶性肿瘤中异常激活，促进肿瘤干性维持、增殖与转移，但免疫细胞来源的蛋白酶对Notch受体的直接切割调控未见报道。基于此，研究人员提出科学假说：CD8+T细胞来源的GzmB可能通过切割HCC细胞表面的Notch1受体，改变其下游信号输出，从而抑制肿瘤进展。
研究内容与主要结论
为验证上述假说，研究人员首先利用免疫组织化学染色和蛋白质印迹（Western blot, WB）技术检测了HCC组织及癌旁组织中CD8+T细胞浸润程度与Notch1表达水平的相关性，发现CD8+T细胞高浸润的肿瘤区域Notch1表达相对较低。随后，研究人员构建了体外共培养体系，将活化的CD8+T细胞与HCC细胞系（如HepG2、Huh7）共培养，发现共培养后HCC细胞中Notch1蛋白水平显著下降，而培养上清中可溶性Notch1胞内域（NICD）片段增加。进一步通过重组GzmB蛋白处理及特异性抑制剂实验，证实GzmB直接切割Notch1蛋白。功能实验表明，GzmB介导的Notch1切割显著抑制HCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并促进细胞凋亡。机制层面，研究人员发现Notch1切割后其下游靶基因Hes1和Hey1表达下调，同时细胞周期调控蛋白（如Cyclin D1）表达减少，凋亡相关蛋白（如Cleaved Caspase-3）表达增加。在体内实验中，研究人员采用异种移植瘤模型，将经GzmB预处理或过表达GzmB的CD8+T细胞过继转移至荷瘤小鼠，结果显示肿瘤生长速度明显减缓，肿瘤体积和重量显著低于对照组，且肿瘤组织中Notch1表达水平显著降低。此外，研究人员还利用Notch1过表达回补实验，验证了Notch1是GzmB发挥抑瘤效应的关键下游靶点。
关键技术方法
本研究主要采用了以下关键技术方法：临床样本队列分析（来源于中山大学附属肿瘤医院HCC手术切除标本，共纳入120例HCC患者组织芯片），用于评估CD8+T细胞浸润与Notch1表达的相关性；体外细胞共培养体系及重组蛋白处理实验，用于验证GzmB对Notch1的切割作用；蛋白质印迹（Western blot, WB）和免疫荧光染色，用于检测蛋白表达及定位；流式细胞术（flow cytometry）用于分析细胞凋亡和细胞周期；异种移植瘤模型（皮下荷瘤NOD/SCID小鼠）用于体内功能验证；以及Notch1过表达和基因敲低实验用于下游机制验证。
研究结果分述
1. HCC组织中CD8+T细胞浸润与Notch1表达呈负相关：通过免疫组织化学染色和定量分析，研究人员发现HCC组织中CD8+T细胞浸润密度高的区域，Notch1表达水平显著降低，提示两者存在潜在的负向调控关系。
2. 活化的CD8+T细胞通过分泌GzmB切割HCC细胞Notch1：体外共培养实验证实，活化的CD8+T细胞可显著降低HCC细胞膜上Notch1蛋白水平，并增加可溶性NICD片段释放；使用GzmB特异性抑制剂或GzmB中和抗体可逆转该效应，直接证明GzmB是介导Notch1切割的关键分子。
3. GzmB切割Notch1抑制HCC细胞恶性表型：CCK-8增殖实验、Transwell迁移和侵袭实验结果显示，GzmB处理或共培养后的HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降；Annexin V/PI双染流式分析显示细胞凋亡率明显升高。
4. Notch1切割下调下游信号通路：WB结果显示，GzmB处理后HCC细胞中NICD、Hes1、Hey1蛋白表达下调，而Cleaved Caspase-3和Bax表达上调，Bcl-2表达下调，表明Notch1信号通路失活并激活线粒体凋亡通路。
5. 过继转移GzmB高表达CD8+T细胞抑制体内肿瘤生长：在异种移植瘤模型中，过继转移GzmB过表达的CD8+T细胞可显著抑制肿瘤生长，肿瘤组织免疫组化显示Notch1表达减少，Ki-67增殖指数降低，TUNEL凋亡染色阳性细胞增多。
6. Notch1回补可逆转GzmB的抑瘤效应：在Notch1过表达的HCC细胞中，GzmB处理不再显著抑制细胞增殖和迁移，表明Notch1是GzmB发挥抗肿瘤功能的关键底物。
讨论与结论
讨论部分指出，本研究首次揭示了CD8+T细胞来源的GzmB通过切割Notch1受体发挥非凋亡性抗肿瘤功能的新机制，拓展了颗粒酶生物学功能的认识，即颗粒酶不仅通过诱导凋亡杀伤肿瘤细胞，还可通过蛋白水解切割关键信号受体重塑肿瘤细胞行为。该发现为HCC免疫微环境中免疫-肿瘤细胞交互作用提供了新的分子解释，并提示Notch1可作为预测免疫治疗疗效的潜在生物标志物。研究结论部分翻译如下：本研究证实CD8+T细胞分泌的GzmB通过特异性切割Notch1受体，抑制Notch1下游信号通路，从而抑制肝细胞癌的增殖、迁移和侵袭并促进凋亡；体内实验进一步验证了该机制的抑瘤作用。该研究为HCC的免疫治疗提供了新的理论依据和潜在干预靶点。
