用2-氨基蒽醌共价修饰氧化石墨烯构建比率型电化学生物传感器用于心肌肌钙蛋白I的定量检测

《Bioelectrochemistry》：Covalently functionalized graphene oxide with 2-aminoanthraquinone for construction of a ratiometric electrochemical biosensor toward cardiac troponin I quantification

　　

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  开发了一种基于 GO-AQ 和 FeMOFs-Au 的比率型生物传感器。
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  经过重氮化后，2-AQ 被共价且牢固地锚定在 GO 上。
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  得益于化学键合，GO-AQ 可以提供稳定的信号输出。
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  得益于框架结构，FeMOFs 可以产生另一个稳定的信号。
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  该比率型生物传感器的性能优于非比率型和已报道的传感器。

引言

心血管疾病（CVDs）包括一系列涉及心脏和血管系统的病理状况，其发病主要与动脉粥样硬化有关。在这些疾病中，急性心肌梗死（AMI）是一种常见的类型 [1]。主要致病因素是冠状动脉阻塞，这中断了心脏的血供，导致心肌组织严重损伤并诱发严重的缺血性心脏病 [2]。因此，对心肌功能障碍进行早期干预在防止永久性心脏损伤方面具有重要意义，这对于 AMI 患者尤为关键。及时的医疗干预可以显著提高患者的预后质量 [3]。

在世界卫生组织（WHO）规定的三项心血管疾病的医学检查中，胸痛症状评估和心电图（ECG）测试都存在局限性 [4]。大多数患者需要进行生化测试以确定生物标志物浓度以做出明确诊断。生物标志物不仅能反映由不同疾病引起的病理过程，还常用于基础和临床研究 [5]。在 AMI 的各种诊断标志物中，心肌肌钙蛋白 I（cTnI）已成为诊断心肌损伤的关键生物标志物 [6]。cTnI 的核心优势是它对心脏损伤的高特异性：AMI 发作后 15 分钟，心肌细胞坏死将 cTnI 释放到血液中，血清浓度显著增加，在 3-6 小时达到峰值 50 ng mL^?1 [7]。当 cTnI 浓度增加到 0.1 ng mL^?1（临界值 0.04 ng mL^?1）时，该水平与 AMI 患者的冠状动脉微循环状况之间存在明显相关性 [8]。此后，开发一个平台以及时准确地检测 cTnI 是非常重要的。

目前，有多种方法可用于检测 cTnI，包括表面等离子体共振（SPR）[9]、光电化学 [10]、电化学传感 [11]、表面增强拉曼散射（SERS）[12] 和质谱 [13]。然而，这些方法都有其自身的缺陷，在检测性能方面仍有改进空间。其中，电化学传感器凭借其高灵敏度、优异的选择性、快速响应、操作简单和低成本等优点，成为 cTnI 检测的理想方法 [11], [14]。然而，传统的电化学生物传感器通常依赖于单一的电化学信号，容易受到环境波动、非特异性吸附和仪器漂移的影响，导致可重复性和可靠性较差 [11], [15]。为了规避这些固有缺陷，比率型电化学传感应运而生，成为一种强大且具有吸引力的分析策略。通过同时监测两个独立的电化学信号并采用它们的电流比进行定量分析，内标法可以有效消除源自复杂生物基质的干扰，包括非特异性吸附、离子强度波动和电活性干扰物。因此，与传统的单信号电化学传感器相比，比率型传感器表现出更高的灵敏度、更好的重现性和更强的抗干扰能力 [16], [17]。理想情况下，这两个电化学信号应该是电化学稳定的，电位分离良好，并且相互独立，以最小化信号重叠和交叉干扰 [18]。因此，开发稳定的双信号材料仍然是构建高性能比率型电化学生物传感器的关键挑战之一。同时，在电极表面上实现电活性分子的稳定固定仍然是一个相当大的挑战，因为弱的物理相互作用容易在重复电化学测量时诱导解吸。

比率型电化学传感器的制备通常涉及传感界面纳米结构的设计和引入具有特定识别功能的分子单元 [18], [19]。在众多流行的纳米材料中，氧化石墨烯（GO）作为一种具有蜂窝晶格结构的二维纳米片，由于其大的可及表面积、优异的化学稳定性和出色的机械强度，在电化学传感领域显示出广泛的应用前景 [20]。然而，其在电化学传感应用中的缺点在于表面缺乏特定的电化学活性位点。2-氨基蒽醌（2-AQ）是一种具有高共轭醌羰基结构的蒽醌化合物，可作为典型的氧化还原活性中心，并在负电位区域发生可逆电子转移反应 [21]。这种性质赋予了 2-AQ 良好的电化学可逆性和化学稳定性，因此常被用作电化学探针 [22]。此外，氨基为碳基材料的化学功能化提供了多功能的反应位点 [23], [24]。通过重氮化反应进行的共价接枝提供了一种有效的策略，它能够在保持电活性的同时，将电活性分子牢固地附着在碳基底上。在重氮反应中，芳基重氮盐产生高反应活性的芳基自由基，这些自由基可以通过形成稳定的 CC 键共价接枝到 GO 的 sp² 碳骨架上，为 GO 的表面功能化提供了一种有效策略 [25]。为了实现稳定的电化学信号输出，我们采用了用 2-AQ 对 GO 进行重氮化修饰的策略以实现稳定接枝。

此外，金属有机框架（MOFs）凭借其高度有序的孔结构和优异的比表面积，为构建比率传感平台开辟了一条新路 [26], [27]。在各种 MOFs 中，铁基 MOFs（FeMOFs）配备了丰富的铁基活性位点、大的多孔比表面积和可调的电子结构，这有利于生物分子的固定和电子转移 [28], [29]。然而，MOFs 固有的电导率低限制了它们在电化学中的进一步应用 [30]。通常，改进方法包括 FeMOFs 的复合、衍生化和元素掺杂 [31], [32]。受此启发，金纳米粒子（Au NPs）原位生长在 FeMOFs 表面，通过协同效应提高复合材料的导电性，并为后续抗体固定提供充足的结合位点。鉴于铁基活性位点，FeMOFs 本身可以在正电位范围内产生稳定且可逆的氧化还原峰，这与 2-AQ 不同，从而实现了比率型传感的构建。

基于上述两种复合材料（GO-AQ 和 FeMOFs-Au）固有的电化学信号的稳定输出，我们构建了一种灵敏的比率型电化学生物传感器。如图 1 所示，GO-AQ 沉积在裸玻碳电极（GCE）上作为基底材料，通过酰胺键捕获捕获抗体（Ab₁），并提供稳定的电化学信号（表示为 I_GO-AQ）。随后，孵育牛血清白蛋白（BSA）和 cTnI，接着引入用 FeMOFs-Au 标记的检测抗体（Ab₂-标签）。通过特异性抗原 - 抗体识别，产生了第二个电化学信号（I_FeMOFs）。随着 cTnI 浓度的增加，两个电化学信号表现出相反的趋势：I_GO-AQ 减小而 I_FeMOFs 增大。因此，选择峰值电流比（I_FeMOFs/I_GO-AQ）作为定量 cTnI 浓度的参数。该比率型电化学生物传感器在检测血清样品中的 cTnI 方面表现出优异的性能。该策略为开发用于灵敏和准确检测 cTnI 的比率型电化学生物传感器提供了一条有前途的途径。

片段

GO-AQ 的制备

GO-AQ 的合成是根据以前报道的程序 [25], [33] 进行了一些修改后完成的。首先，将 22.3 mg 2-AQ 分散在 7 mL 乙腈中，并在超声作用下溶解 30 分钟。然后，在 50 °C 下搅拌悬浮液 12 小时，直至完全溶解。冷却后，注入 22 μL 亚硝酸叔丁酯。30 分钟后，注入相同量的亚硝酸叔丁酯并搅拌 30 分钟，以原位生成蒽醌 -2- 重氮阳离子。然后，

材料表征

为了验证 GO-AQ 复合物的成功合成，采用扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外（FTIR）光谱、紫外 - 可见（UV–vis）吸收光谱和泽塔电位测量对制备的材料进行了表征。首先，使用 SEM 表征其形貌。如图 1A 所示，GO-AQ 复合物由许多相互连接和堆叠的纳米片组成，具有整体的蓬松网络结构，保持了基本的

结论

基于抗体和抗原的特异性结合，我们用 GO-AQ 修饰电极，并使用 FeMOFs-Au 作为信号探针，成功构建了一种双信号输出的比率型电化学生物传感器。由于 GO 的高比表面积，大量的信号分子 2-AQ 可以牢固地接枝在其表面，从而实现了稳定的信号响应。结合增强的电导率和独特的结构优势，FeMOFs-Au 能够产生

CRediT 作者贡献声明

崔子文：写作 – 初稿、可视化、验证、软件、方法论、调查、数据整理。丁世齐：验证、软件、方法论、调查、数据整理。辛圣祥：验证、方法论、调查、数据整理。张文泽：软件、方法论、调查、数据整理。牛子淮：验证、方法论、调查、数据整理。刘明军：资源、方法论、调查、正式分析。李珊珊：写作 –

伦理声明

已获所有参与者或其法律代表的书面知情同意，同意参与本研究并发表文章。已尊重参与者的隐私权。

本研究包括器官或组织捐赠者。本研究包括人类生物材料，捐赠者或其亲属或法律代表同意将其用于本研究并发表文章。本研究使用的样品不是来自被执行的

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系，这些关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

这项工作得到山东省自然科学基金（ZR2025MS241）和国家自然科学基金（22004076）的支持。

崔子文|丁世齐|辛圣祥|张文泽|牛子淮|刘明军|李珊珊