基于可调低临界溶解温度的热敏固定化枯草芽孢杆菌制剂用于人参根腐病的温控生物防治

《Biological Control》：A thermosensitive immobilized Bacillus subtilis agent with tunable LCST for temperature-triggered biocontrol of ginseng root rot

　　

本研究开发了一种新型热敏固定化微生物制剂，用于温控生物防治人参根腐病。研究人员将生物炭基固定化载体与壳聚糖/羟丙甲纤维素（HPMC）热敏水凝胶相结合，制备了具有可调低临界溶解温度（LCST）的复合壁材。通过氯化钠（NaCl）浓度调控，将LCST调节至25–28°C范围，使其与田间人参根腐病高发期的温度区间相匹配。当环境温度超过LCST时，水凝胶发生溶胶-凝胶相转变，触发枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）EREM-504的快速释放。扫描电镜（SEM）显示，热敏制剂（S24）具有蜂窝状多孔结构及高度互连的通道，有利于细菌释放。温度依赖性释放动力学表明，在27°C条件下，S24制剂的T63（累积释放达63.2%所需时间）为7.87小时，显著短于非热敏制剂（HS）的16.02小时。盆栽试验中，在20°C/27°C变温条件下，S24制剂对人参根腐病的防效达76.79%，显著优于同等剂量的HS制剂（61.73%）及商品枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（WP）（40.09%）。该研究首次将热敏水凝胶与生物炭固定化技术耦合，实现了病原菌侵染高峰期温度驱动的智能释放，为田间不稳定环境下生物防治效果的提升提供了新策略。

研究背景与现存问题

人参（Panax ginseng C. A. Meyer）是中国最具经济价值的药用植物之一，其可持续栽培长期受土传病害制约。由茄病镰刀菌（Fusarium solani）引起的人参根腐病危害尤为严重，显著降低产量与品质。生物防治作为一种环境友好型手段，已成为人参病害管理的重要补充。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）能够产生脂肽和多肽等抗菌化合物，对多种植物病原真菌具有较强生防潜力。然而，目前商业化的枯草芽孢杆菌可湿性粉剂（WP）和悬浮剂施入土壤后，活菌细胞立即面临温度波动、干燥、酸碱度（pH）胁迫、营养限制以及与土著微生物竞争等不利因素，导致存活率低、定殖差、与靶标病原菌有效接触时间短。传统制剂无法主动响应环境信号，难以在病害高发期维持足够的生防菌种群数量，田间效果不稳定，严重限制了大规模农业应用。

微生物固定化技术可将高密度菌体包埋于特定基质内，形成保护性微环境并提供营养，延长细胞存活并保持生物活性。其中，生物炭因具有高比表面积、高孔隙率和丰富的表面官能团，展现出优异的微生物固定化潜力。然而，传统固定化载体提供的空间保护往往缺乏响应环境信号释放菌体的能力。近年来，材料科学与生物学的交叉发展产生了刺激响应性材料，能够感知温度、pH等环境信号并发生相转变以释放活性物质，为克服传统载体的局限性提供了新思路。低于低临界溶解温度（LCST）时，热敏水凝胶呈自由流动的溶胶态，便于施用和渗透；超过LCST则迅速触发溶胶-凝胶转变，在靶位形成储库并持续释放。理论上，将生物炭固定化载体与这类水凝胶结合，可同时实现物理保护与温度触发释放。然而，其与微生物制剂工艺的兼容性、LCST向田间温度范围的可调性以及对靶标病原菌拮抗效能的影响，尚缺乏系统的实验验证。前期研究表明，温度是影响枯草芽孢杆菌存活的关键环境因子，而人参根腐病的高峰期常与特定温度区间吻合。因此，研究人员提出将生物炭固定化载体与热敏水凝胶耦合，开发一种热敏固定化微生物制剂，旨在环境温度超过LCST时触发生防菌释放，并系统研究了其温度依赖性释放行为及对人参根腐病的田间防效。

关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：（1）以海藻酸钠和改性稻壳生物炭为复合壁材，通过挤压滴注法和钙离子交联制备非热敏的生物炭固定化菌剂（HS），并通过单因素实验和L₉(3⁴)正交设计优化包封效率和机械强度；（2）以壳聚糖和羟丙甲纤维素（HPMC）为原料制备热敏水凝胶（S1），通过氯化钠（NaCl）浓度调节LCST至25–28°C，再与海藻酸钠-生物炭溶液按不同体积比混合得到复合壁材溶液（S2），最终制备热敏固定化菌剂（S24）；（3）通过浊点测定法和试管倒置法确定LCST，利用平板计数法测定包封效率，通过压缩法测定机械强度，通过称重法测定溶胀比；（4）采用扫描电镜（SEM）观察微观形貌；（5）在磷酸盐缓冲液（PBS，pH 6.0）中于24°C、27°C、30°C和33°C下测定温度依赖性释放动力学；（6）开展常温条件和20°C/27°C变温条件下的盆栽防效试验，以病指（DI）和防效（CE）评价生防效果。

研究结果

3.1 生物炭固定化菌剂（HS）的制备与优化

单因素实验中，单独使用海藻酸钠作为壁材时包封效率为41.87%–53.99%，机械强度随海藻酸钠浓度升高而增加；综合考虑高活菌载量需求，选择2%海藻酸钠为最优浓度。加入生物炭后包封效率显著提高，在3%生物炭时达到91.44%，较2%海藻酸钠单独处理提高69.37%（p < 0.05）。正交优化以包封效率为首要指标、机械强度≥30 mN为约束条件，确定最优组合为2%海藻酸钠、2.5%氯化钙（CaCl₂）、2%生物炭、固定化时间1.5小时。验证实验表明，此条件下制备的HS活菌数达（4.93 ± 0.21）× 10⁹ CFU/g。

3.2 热敏固定化菌剂（S24）的制备与热敏特性

壳聚糖/HPMC水凝胶原始LCST为52°C，远高于田间根腐病高发期温度（20–28°C）。通过添加NaCl可降低LCST，在7% NaCl时LCST降至27°C，符合目标区间，该配方被命名为S1水凝胶。将S1与海藻酸钠-生物炭溶液按不同比例混合后，S24（体积比4:1）综合性能最佳。LCST测定显示，S24复合材料在4°C时保持流动性，27°C时试管倒置无流动，透光率下降36.52%，表明加入海藻酸钠和生物炭后仍保留了S1的热敏行为。温度依赖性溶胀实验表明，HS的溶胀比从24°C的54.48%随温度线性上升，无拐点；而S24在24°C时为46.39%，升至27°C时溶胀比下降13.26%，之后趋于稳定（变异系数CV = 2.49%），证明S24具有明显的热敏溶胀特征，拐点与LCST一致。

3.3 固定化菌剂的微观形貌与释放动力学

HS与S24均呈近似球形，未干燥状态直径分别为3.50 ± 0.32 mm和3.46 ± 0.27 mm，冻干后分别缩小至1.75 ± 0.08 mm和1.72 ± 0.11 mm，两者无显著差异。SEM观察显示，HS截面呈现不规则且孔径分布广泛的多孔结构；S24截面除不规则大孔外，还含有丰富、均匀、薄壁且高度互连的蜂窝状通道。在27°C条件下，S24的T₆₃（累积释放达63.2%所需时间）为7.87小时，显著短于HS的16.02小时；S24的R₈（8小时累积释放率）为64.35%，远高于HS的30.31%。在24°C（低于LCST）时，S24与HS的释放曲线相近，无明显差异。

3.4 生防效果评价

常温盆栽试验中，各处理间防效差异不显著。而在20°C/27°C变温条件下，9S24处理（6.04 × 10⁸ CFU/盆）的防效达76.79%，显著高于同剂量9HS处理的61.73%（p < 0.05），也显著优于商品枯草芽孢杆菌WP（K5，40.09%）和化学农药多菌灵（D5，67.70%）。S24在变温条件下的防效较常温条件提升了42.89%，而HS仅提升2.35%，证实了温度触发释放机制的有效性。

讨论与结论

研究人员指出，S24的蜂窝状互连通道结构归因于热敏水凝胶的引入改变了壁材组装方式，这种结构有利于水分快速进入和细菌向外扩散。温度依赖性释放数据明确表明，S24在LCST以上（27°C）实现了快速释放，而HS的释放速率主要受被动扩散控制。变温盆栽试验中，S24在高温时段（27°C）触发快速释放，使生防菌群体在病原菌侵染高峰期达到有效浓度，从而显著提升防效。相比之下，常温条件下温度未达到LCST，S24与HS的释放行为相似，防效也无显著差异，进一步证实了温度触发的智能释放机制。

研究结论：本研究成功将生物炭固定化载体与热敏水凝胶耦合，开发出一种具有可调LCST的热敏固定化枯草芽孢杆菌制剂（S24）。该制剂在环境温度超过LCST时触发快速释放，在变温条件下对人参根腐病的防效达76.79%，显著优于非热敏制剂和商品制剂。这一温度响应策略为克服传统生防制剂在田间不稳定环境下的局限性提供了新思路，有望推动智能、持续的生防菌施用技术在人参栽培中的应用。