《Food Biophysics》：Biophysical Characterization of Interactions Between Human Salivary Proteins and Quinine
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唾液是苦味化合物进入口腔后遇到的第一种生物介质，唾液蛋白一直被间接认为与苦味感知有关。然而，目前尚无关于唾液蛋白-苦味剂相互作用的直接生物物理表征报道。本研究采用互补的生物物理技术，研究了唾液蛋白与模式苦味剂奎宁之间的相互作用。研究人员将来自44名健康志愿者的
唾液是苦味化合物进入口腔后遇到的第一种生物介质，唾液蛋白一直被间接认为与苦味感知有关。然而，目前尚无关于唾液蛋白-苦味剂相互作用的直接生物物理表征报道。本研究采用互补的生物物理技术，研究了唾液蛋白与模式苦味剂奎宁之间的相互作用。研究人员将来自44名健康志愿者的混合全唾液(WS)通过3 kDa滤膜分离为高分子量(HMW)和低分子量(LMW)组分。利用荧光光谱法、沉降速度分析超速离心(SV-AUC)和等温滴定量热法(ITC)对蛋白质-奎宁相互作用进行了表征。荧光光谱法显示，表观未结合奎宁浓度呈浓度依赖性降低，在WS中蛋白质浓度为0.6 mg/mL时未结合奎宁比例为59.28 ± 0.89%，且LMW组分比HMW组分表现出更强的表观结合。SV-AUC提供了蛋白质-奎宁复合物形成的证据，其中LMW组分通过出现新的、更高沉降系数的物质而表现出最明显的变化，提示奎宁诱导的多聚化。ITC显示所有三种唾液系统均存在吸热结合，与WS(ΔH = 0.321 ± 0.548 kcal/mol)和HMW组分(ΔH = 0.081 ± 0.158 kcal/mol)相比，LMW组分表现出最大的表观结合焓变化(ΔH = 1.053 ± 0.009 kcal/mol)。这些发现共同证明人唾液蛋白与奎宁相互作用，其中LMW组分(< 3 kDa)表现出最强的表观结合(根据荧光测量，在蛋白质浓度为0.2 mg/mL时未结合奎宁减少17.53 ± 1.58%)。这项工作首次对唾液蛋白-苦味剂相互作用进行了生物物理表征，并为未来研究唾液蛋白在苦味感知中的作用奠定了基础。
味觉感知始于食物中的味觉活性化合物与相应受体细胞的结合，但在味质与受体作用之前，它首先接触唾液。唾液含有超过5500种蛋白质和多肽，包括黏蛋白、α-淀粉酶、胱抑素、富脯氨酸蛋白(PRPs)等。已有大量间接证据表明唾液蛋白参与涩味感知，而关于苦味感知的相关性研究也提示某些唾液蛋白（如PRPs、胱抑素、碳酸酐酶VI等）与苦味敏感度和接受性有关。然而，这些研究多依赖于相关性，缺乏直接的机制证据，特别是尚未见到对唾液蛋白与纯苦味化合物相互作用的直接生物物理表征。本研究以模式苦味剂奎宁为对象，提出假设：人唾液蛋白能够与奎宁相互作用，且不同唾液蛋白组分的结合能力和理化特征存在差异。研究人员从宾夕法尼亚州立大学校园及周边地区招募44名健康志愿者，收集副蜡膜刺激的全唾液(WS)，经蛋白酶抑制剂处理和离心后合并，使用3 kDa超滤膜分离为高分子量(HMW)和低分子量(LMW)组分。通过荧光光谱法、沉降速度分析超速离心(SV-AUC)和等温滴定量热法(ITC)三种互补技术直接表征相互作用。结果表明，人唾液蛋白与奎宁确实存在可测量的结合，其中低于3 kDa的LMW组分在单位蛋白质量基础上表现出最强的表观结合。该研究首次提供了唾液蛋白-苦味剂相互作用的直接生物物理证据，为后续探究唾液蛋白在苦味感知中的调控作用奠定了重要基础。
关键方法方面，研究人员使用来自44名健康志愿者的合并刺激唾液（宾夕法尼亚州立大学周边地区）。样本经3 kDa MWCO超滤膜分为HMW和LMW组分。核心检测技术包括：荧光光谱法（激发347 nm，发射360-580 nm，通过奎宁荧光淬灭及校准曲线估算表观未结合奎宁浓度）；沉降速度分析超速离心(SV-AUC，60,000 rpm、20 °C，利用Lamm方程拟合得到沉降系数分布)；等温滴定量热法(ITC，8 mM奎宁滴定0.2 mg/mL蛋白，25 °C，测定表观结合焓)。蛋白浓度采用BCA法测定，蛋白谱图通过SDS-PAGE比较。
研究结果如下。
唾液蛋白浓度、pH与电泳图谱：WS总蛋白浓度处于健康人正常范围（0.5-2.0 mg/mL），pH为7.98；HMW组分总蛋白浓度高于WS，LMW组分低于WS。SDS-PAGE显示WS与HMW组分条带模式相似，主要条带位于50-75 kDa；LMW组分未出现明显条带，符合其富含<3 kDa蛋白/肽的特点。
荧光淬灭分析：随着WS蛋白浓度从0增加到0.6 mg/mL，奎宁荧光强度呈浓度依赖性下降，并在蛋白浓度≥0.36 mg/mL时发射峰从390 nm蓝移至388 nm，提示奎宁进入更疏水的微环境。在0.6 mg/mL蛋白浓度下，未结合奎宁比例为59.28 ± 0.89%，线性回归模型拟合良好(R2=0.99)。在0.2 mg/mL蛋白浓度下，LMW组分的未结合奎宁比例为82.47 ± 1.58%，明显低于HMW组分的97.23 ± 2.78%，WS居中（86.96%），表明LMW组分表观结合能力更强。与前期研究中的酪蛋白酸钠(NaCas)相比，唾液蛋白在约4.3倍更低的蛋白浓度下达到相同的未结合奎宁降幅，提示唾液蛋白具有更强的奎宁结合能力。
SV-AUC表征：无奎宁条件下，WS的沉降系数分布显示0.09 S（小分子蛋白/肽）、1.5 S（α-淀粉酶）、4.4 S（黏蛋白）和11.33 S（免疫球蛋白A，IgA）峰；HMW组分类似，LMW组分仅见0.14 S峰。加入奎宁后，WS和HMW组分中α-淀粉酶、黏蛋白和IgA峰信号降低，HMW组分出现新的12.4 S物质；LMW组分则出现5.2 S、6.23 S和7.3 S三个新峰，提示奎宁诱导形成不同大小或化学计量比的复合物。这些结果从沉降行为上证实了蛋白质-奎宁复合物的形成，且LMW组分的证据最清晰。
ITC研究：三种唾液系统均表现为正表观结合焓（吸热结合）。LMW组分的表观结合焓最大(ΔH = 1.053 ± 0.009 kcal/mol)，WS(ΔH = 0.321 ± 0.548 kcal/mol)和HMW组分(ΔH = 0.081 ± 0.158 kcal/mol)较小且置信区间较宽。LMW组分在约38次注射后热信号逐渐下降，趋于饱和；WS和HMW组分的信号在整个滴定过程中几乎恒定，提示弱非特异性结合。正焓变可能主要来自去溶剂化效应以及疏水相互作用的贡献。
讨论部分指出，LMW组分结合能力较强可能与以下因素有关：小分子肽构象灵活性高、潜在结合位点暴露程度大；糖基化程度低；在同等蛋白质量下分子数目更多；以及蛋白水解片段可能仍保留配体结合能力。但具体结合蛋白/肽尚未鉴定。本研究存在局限性：混合唾液掩盖了个体间蛋白组差异；未鉴定具体结合分子；荧光法估算未结合奎宁为表观值；因唾液成分复杂、无明确摩尔浓度，ITC仅能提供表观结合焓，无法计算化学计量和结合常数；未进行心理物理学或受体激活测试。结论部分翻译如下：本研究通过荧光光谱法、SV-AUC和ITC三种互补技术，首次对人唾液蛋白及分级组分与奎宁的相互作用进行了直接生物物理表征，证明人唾液蛋白与奎宁发生可测量的相互作用，其中<3 kDa的LMW组分表现最强。该发现为未来研究唾液蛋白组成对苦味感知个体差异的影响，以及通过调节蛋白-苦味剂相互作用来降低食品和药物苦味的潜在策略提供了基础。
