构建缺氧生成水凝胶以增强前药Evofosfamide在肺癌模型中的抗癌活性

《Biomaterials Advances》：Engineering a hypoxia-generating hydrogel to enhance the anticancer activity of prodrug Evofosfamide in lung cancer models

　　**摘要要点**• 一种剪切变稀水凝胶在常氧条件下可产生局部缺氧 • 漆酶–没食子酸体系可在凝胶内部实现快速且可控的耗氧 • 负载 Evofosfamide 的水凝胶可提供长达七天的持续释放 • 水凝胶诱导的缺氧环境增强了 Evofosfamide 对 A549 癌细胞的作用 • 治疗效果在二维和三维 A549 细胞模型中均可复现 **引言**肿瘤缺氧已成为决定肿瘤侵袭性、转移潜能以及对常规治疗耐药性的关键因素[1, 2, 3, 4, 5]。缺氧通常指氧含量低于 5%，是大多数实体肿瘤的标志性特征，源于癌细胞快速增殖超出局部血管供氧能力[6]。当快速增殖的癌细胞超出周围血管所能提供的氧供应量时，肿瘤内部便形成缺氧区，导致肿瘤组织内出现异质性氧梯度。这些缺氧区域深刻影响癌细胞行为并引发适应性反应以支持肿瘤存活。代谢重编程进一步促进缺氧微环境的形成，许多癌细胞表现出 Warburg 表型，即使在常氧条件下也维持较高的糖酵解活性[7, 8, 9]。尽管这种代谢改变支持快速增殖与生物合成，但也增加了代谢需求并加剧肿瘤微环境的氧消耗[10, 11]。细胞对缺氧的应答主要由缺氧诱导因子（HIFs）调控，HIFs 控制与血管新生、代谢适应及细胞存活相关的基因表达[12, 13]。HIF 的激活促进血管新生通路，包括血管内皮生长因子（VEGF），从而帮助肿瘤适应低氧条件[6, 14]。值得注意的是，缺氧区域肿瘤往往对化疗和放疗敏感性降低，这在肺癌患者中导致疗效欠佳[6, 15]。缺氧肿瘤微环境的独特生化特征推动了靶向缺氧区域的治疗策略开发[6, 16, 17, 18, 19]。缺氧激活型前药（HAPs）是一类有前景的药物，旨在低氧条件下选择性释放细胞毒剂[20, 21, 22, 23, 24]。Evofosfamide（TH-302）是一种缺氧激活型生物还原前药，可选择性地在缺氧环境中经历酶促还原，释放强效 DNA 烷化细胞毒基团[24, 25, 26]。利用肿瘤相关缺氧，Evofosfamide 旨在提高治疗选择性的同时最大程度减少对常氧正常组织的损伤[27, 28]。然而，由于实体肿瘤内部缺氧分布异质且空间可变，准确评估和优化缺氧激活型药物的疗效仍然具有挑战性。针对 Evofosfamide 在包括非小细胞肺癌在内的实体肿瘤中的临床研究报道疗效有限，归因于缺氧区域不足或不均一，难以实现高效前药激活[28, 29, 30]，同时也缺乏临床前模型支持。传统的二维细胞培养体系无法充分捕捉肿瘤组织的结构复杂性和微环境异质性，尤其难以再现体内的氧梯度。因此，基于生物材料的三维培养平台和细胞聚集体系统已成为在可控条件下模拟肿瘤微环境的有力工具[31]。近年来生物材料工程的进展使得开发产生缺氧的水凝胶系统成为可能，该系统能够在三维基质内重现缺氧微环境[16, 32]。此类系统通常依赖耗氧酶促反应来局部降低氧浓度并在凝胶网络内建立缺氧条件[16, 32]。已有多种酶学策略被探索用于创建缺氧微环境，包括氧化酶类系统如葡萄糖氧化酶或漆酶介导的反应，在催化过程中消耗溶解氧[16]。通过调节局部氧含量，这些生物材料平台可实现肿瘤相关的缺氧微环境形成，并便于在受控实验条件下研究细胞对缺氧的反应。在现有的缺氧发生水凝胶策略中，漆酶介导的系统和葡萄糖氧化酶（GOx）系统代表两种常用的酶学方法。Park 和 Gerecht 证明漆酶交联的明胶-阿魏酸水凝胶可通过酶促耗氧在凝胶形成过程中产生可控的氧梯度，后续的氧可控水凝胶系统进一步表明漆酶介导反应可生成空间定义明确的缺氧微环境，模拟组织与肿瘤中的生理氧梯度[16, 32]。近期研究报道了一种包含漆酶介导耗氧的缺氧诱导型互穿聚合物网络（IPN）水凝胶微球，可降低局部氧张力并维持缺氧状态以促进椎间盘再生，凸显了酶促氧调控在再生生物材料中的更广泛应用价值[33]。GOx 系统通过葡萄糖氧化提供快速耗氧的替代途径；然而该反应会生成过氧化氢（H?O?）作为副产物，可能引入氧化应激并干扰细胞反应，除非辅以额外的过氧化物清除策略。尽管取得了上述进展，现有耗氧水凝胶系统主要集中于生成或模拟缺氧微环境，而尚未充分利用局部缺氧进行治疗激活。除作为肿瘤模拟培养平台外，水凝胶在癌症治疗中作为局部药物递送系统也备受关注[34, 35, 36]。可注射水凝胶制剂可提高瘤内药物滞留，实现药物持续释放，并相较传统给药方式降低全身毒性。特别是剪切变稀水凝胶代表一类新型可注射生物材料，具有在剪切应力下黏度可逆性降低及注射后结构快速恢复的特性[34, 37]。这种流变学行为使材料在注射时流动，而在去除外力后迅速恢复结构完整性，使该系统在瘤内药物递送和局部调节肿瘤微环境方面极具吸引力。本研究报告了一种基于漆酶-没食子酸的缺氧发生型剪切变稀水凝胶平台的开发与表征，该平台旨在模拟肿瘤相关的缺氧微环境，同时作为前药 Evofosfamide 的局部药物递送系统（图 1A）。我们利用 A549 肺癌细胞系作为模型，研究了该生物材料系统能否产生可控的缺氧微环境，并在体外体系中增强缺氧激活型前药 Evofosfamide 的治疗活性（图 1B）。该方法将缺氧调控型生物材料与肿瘤模拟培养系统相结合，为研究肿瘤缺氧和提高缺氧激活型抗癌药物的疗效提供了多功能平台。**分节摘要****材料与细胞系**A 型猪皮明胶、蘑菇漆酶冻干粉（≥4.0 单位/mg）、没食子酸、紫丁香酮及杜尔贝科改良伊氏培养液（DMEM）高糖均购自 Sigma Aldrich。Evofosfamide 购自 Selleck Chemicals。活/死细胞活力试剂盒、PrestoBlue 细胞活力检测试剂及杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS；GIBCO）购自 Thermo Fisher Scientific。合成纳米黏土（Laponite）购自美国德克萨斯州 BYK Additives Ltd.。**结果与讨论**设计了一种剪切变稀缺氧凝胶（STHH），整合了耗氧的漆酶-没食子酸酶体系与缺氧激活型前药 Evofosfamide（Evo）。这些研究旨在评估 STHH 不仅能够作为药物递送基质，还能作为微环境调节平台，支持缺氧响应型治疗激活。**结论**本研究开发了一种剪切变稀缺氧诱导水凝胶（STHH），作为可控缺氧微环境生成的氧调节平台。基于漆酶的系统有效降低了凝胶内的氧浓度，使在常氧条件下实现缺氧成为可能。缺氧激活型前药 Evofosfamide 被成功整合进 STHH 体系，从而在单一系统中实现缺氧生成与氧依赖性药物激活的结合。**作者贡献声明（CRediT）****Zeynep Islek：** 论文撰写–审阅与编辑、论文撰写–初稿、可视化、验证、方法学、调查研究、资金获取、正式分析、数据管理、概念构思。**Keuna Jeon：** 论文撰写–审阅与编辑、论文撰写–初稿、可视化、验证、方法学、调查研究、正式分析、数据管理。**Menekse Ermis：** 调查研究、数据管理。**Ezgi Taskan：** 数据管理。**Serra Naz Gudumgen：** 数据管理。**P?nar Akkus Sut：** 调查研究，**作者贡献**NF 和 ZI 共同构建了研究框架并确立了实验体系。NF 提供了研究资金并对研究进行指导。ZI 开发并制备了 STHH 系统并建立了实验流程。STHH 的制备由 ZI 完成。ZI 和 NF 设计了材料表征和细胞培养研究的框架。ZI 和 KJ 开展了表征研究，ZI 完成了全部细胞培养研究。ZI 和 KJ 进行了分析并解释……**关于生成式 AI 及 AI 辅助技术在撰写过程中使用的声明**在本文撰写过程中，使用了 ChatGPT 进行语言编辑。作者已仔细审阅并修改全部内容，并对最终稿件承担全部责任。**利益冲突声明**作者声明不存在利益冲突。**致谢**感谢 Ali Khademhosseini 博士对本研究概念设计的宝贵见解和贡献。作者感谢来自美国国立卫生研究院（1R01DK130566-01、1R01CA257558-01）和特拉萨基生物医学研究所（美国加利福尼亚州洛杉矶）的资金支持。K.J. 感谢加拿大自然科学和工程研究委员会（NSERC）提供的博士后奖学金（PDF）。qPCR 研究由遗传学部……资助。Zeynep Islek｜Keuna Jeon｜Menekse Ermis｜Ezgi Taskan｜Serra Naz Gudumgen｜P?nar Akkus Sut｜Nedim Can Cevik｜Natashya Falcone