FRESH生物打印中细胞活性和丝状体形态的多物理场预测框架

《Biomaterials Advances》：A multiphysics predictive framework for cell viability and filament morphology in FRESH bioprinting

　　

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  提出一种基于能量剂量的细胞活性模型。
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  阐明挤出丝体的形态学机制，并定义可打印性窗口的定量标准。
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  实现对FRESH生物打印中打印细胞活性的定量预测。

引言

载细胞生物打印是一种增材制造技术，通过在三维（3D）空间中精确沉积生物墨水来构建仿生组织，已广泛应用于创建组织支架[1]、[2]、[3]、[4]等工程化生物结构。近年来，挤出式生物打印（EBB）凭借其操作简便以及与多种生物墨水配方兼容性强而快速发展，成为应用最广泛的生物打印方式之一[5]、[6]。作为EBB的一种先进变体，自由形式可逆悬浮水凝胶嵌入（FRESH）生物打印在支撑浴中构建三维结构，能够创建具有精细微结构和特定功能的组织构建体[7]。该方法降低了对高粘度生物墨水的依赖，从而缓解了低粘度生物墨水的可打印性挑战[8]、[9]。因此，FRESH生物打印支持构建机械性能更接近天然组织的复杂三维结构[10]、[11]。

在FRESH生物打印中，喷嘴浸入支撑浴中，并沿预定义工具路径执行三维运动。打印过程中，生物墨水通过喷嘴挤出并沉积到具有屈服应力的支撑浴中，在原地被稳定成形[12]。由于挤出和成形均在支撑浴内完成，打印结构有效避免了重力引起的变形和坍塌，无需牺牲性支撑[12]、[13]。支撑浴通常由密集排列的微凝胶颗粒组成，其颗粒网络可在类固态和类流体态之间可逆转变[14]。随着喷嘴移动，产生的剪切力破坏了微凝胶间的可逆非共价相互作用，导致局部液化。剪切力停止后，这些相互作用迅速重新形成，使浴液重新固化，从而固定已沉积的生物墨水[15]。因此，微凝胶的特性对打印构建体的尺寸精度和形状保真度至关重要[16]、[17]、[18]。已有研究表明，通过调整微凝胶粒径和配方，FRESH可实现约20 μm的最小特征尺寸，远超传统挤出式打印的沉积分辨率[15]、[18]。此外，支撑浴可在整个打印过程中保持生理温度，有助于维持细胞活性[19]。近年来，FRESH生物打印已成功应用于构建可灌注血管、心脏组织和小器官模型[20]、[21]。

与传统EBB相比，FRESH的另一个显著优势是其与低粘度生物墨水的兼容性，这降低了高粘度配方带来的细胞损伤风险[22]、[23]。然而，FRESH打印过程通常采用细长的圆柱形喷嘴。与传统的锥形喷嘴相比，细长喷嘴延长了细胞暴露于剪切应力的时间，可能导致细胞损伤[24]。因此，阐明FRESH生物打印中细胞损伤的主导机制并建立具有普适性的定量预测模型至关重要。迄今为止，针对FRESH的预测模型仍然稀缺，可用的实验数据集也相对有限[20]、[25]。在先前的研究中，多项式回归常被用作经验拟合方法。虽然可以获得较高的拟合精度，但此类模型通常涉及大量参数且物理可解释性有限，阻碍了其向不同工况或打印平台的外推[25]。另一类简化模型利用幂律关系将细胞损伤百分比（$\mathit{CD},\%$）与剪切应力（$\tau$）直接关联：$\mathit{CD}\left(\%\right)=k{\tau }^a$，其中 k 和 a 为拟合系数[19]、[26]。该公式忽略了暴露时间的影响，因此不适合FRESH细长喷嘴的长路径挤出特征。更复杂的模型同时纳入剪切应力$\left(\tau \right)$和暴露时间$\left(t\right)$来描述细胞损伤：$\mathit{CD}\left(\%\right)=c{\tau }^a{t}^b$[24]、[27]。然而，这些模型通常使用平均应力值进行参数化，未考虑细胞在不同位置所经历的剪切应力的空间异质性。从机制角度来看，膜破裂和不可逆变形被认为是细胞损伤的主要途径。相应地，部分研究通过模拟膜变形或测量膜通透性来定量评估细胞活性[28]、[29]。这些工作通过建立膜损伤与施加于细胞的累积机械能之间的联系，提供了另一种视角。尽管如此，基于膜力学的模型往往结构复杂且参数众多，限制了其适用性并阻碍了向实际工程工具的转化[9]、[28]。综上所述，这些局限性表明现有大多数模型侧重于瞬时应力或平均应力指标，缺乏时空分辨率。此外，对于FRESH生物打印而言，将支撑浴流变学、挤出流场和细胞损伤模型统一在一个预测框架中的综合性研究仍然显著缺乏。

本研究提出了一种基于能量剂量的细胞活性模型，并将其与FRESH打印模拟相结合，构建了一个用于预测打印细胞活性和丝体形态的多物理场框架（图1）。具体而言，通过实验测量不同剪切应力和暴露时长下的细胞活性，对细胞活性模型进行参数化并建立损伤-活性映射关系。作为第二个组成部分，表征了不同浓度载细胞生物墨水的流变性能以及在不同离心力下制备的支撑浴，并开展计算流体力学（CFD）模拟以阐明挤出丝体形态的演化过程并定量界定可打印性窗口。在这两个组成部分的基础上，将CFD导出的剪切应力场与细胞活性模型相结合以预测打印细胞活性。同时，分析了喷嘴内细胞所经历的剪切应力历史，并量化了细胞损伤对关键打印参数的敏感性。最后，通过将模型预测与打印实验进行对比来验证所提出的框架。

章节摘要

材料

明胶和海藻酸钠购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。磷酸盐缓冲液（PBS）购自北京索莱宝科技有限公司（中国北京）。Pluronic F127和氯化钙（CaCl₂）购自Sigma-Aldrich（中国上海）。阿拉伯胶（来自金合欢树）购自Sigma-Aldrich（中国上海）。HT22小鼠海马神经元细胞和最低必需培养基（MEM）购自

细胞活性响应与统计分析

图2a-b展示了剪切应力对水凝胶内细胞形态的影响。与对照组相比，部分承受剪切载荷的细胞表现出不可逆损伤特征，包括膜破裂、细胞轮廓模糊和胞内物质泄漏，表明剪切应力可直接损害细胞的结构性完整性。定量结果汇总于图2c。在低应力、短时暴露条件下细胞活性保持较高

结论

本研究建立并验证了一个适用于FRESH生物打印中载细胞挤出的多物理场预测框架，实现了对打印细胞活性和打印结果的定量预测。所建立的细胞活性模型与实验数据表现出优异的一致性（R² = 0.97，RMSE = 2.2%）。CFD分析阐明了丝体尾流上浮和截面形态演变的力学机制，并用于界定可打印区域

CRediT作者贡献声明

Chen Zhuang：写作——初稿，方法论，调查，概念化。Huang Chuanzhen：写作——审阅与编辑，监督，经费获取，概念化。Liu Hanlian：写作——审阅与编辑。Wang Zhen：写作——审阅与编辑。Xu Longhua：写作——审阅与编辑。Huang Shuiquan：写作——审阅与编辑。Qu Meina：写作——审阅与编辑。Xu Zhengkai：写作——审阅与编辑。Han Xu：写作——审阅与编辑。Li Shuying：写作——审阅与

利益冲突声明

作者声明不存在已知的竞争性财务利益或个人关系，这些关系可能影响本文所述工作的完成情况。

致谢

本研究得到国家重点研发计划（2022YFB4601401）和国家自然科学基金（52275464和52475472）的经费支持。

Chen Zhuang|Huang Chuanzhen|Liu Hanlian|Wang Zhen|Xu Longhua|Huang Shuiquan|Qu Meina|Xu Zhengkai|Han Xu|Li Shuying|Huang Jun