丝素蛋白通过mTOR信号通路促进C2C12成肌细胞分化的机制研究

《Applied Biological Chemistry》：Effects of silk fibroin on myoblasts differentiation in C2C12 cells

　　

肌肉减少症（sarcopenia）的特征是骨骼肌质量和功能的进行性丧失，主要与肌原性分化（myogenic differentiation）和蛋白质合成受损有关。本研究探讨了来源于家蚕（Bombyx mori）茧的丝素蛋白（silk fibroin）对C2C12成肌细胞（myoblasts）肌原性分化和肌管（myotube）形成的影响，并探索了其与mTOR信号通路相关的潜在分子机制。丝素蛋白主要由游离氨基酸中的甘氨酸（glycine）、丙氨酸（alanine）和丝氨酸（serine）组成，并含有支链氨基酸（branched-chain amino acids, BCAAs），包括缬氨酸（valine）、亮氨酸（leucine）和异亮氨酸（isoleucine）。丝素蛋白处理增强了肌管形成，并在50 μg/mL浓度下显著增加了肌管直径，达到12.47 μm，而对照组为9.90 μm。此外，50 μg/mL丝素蛋白处理显著上调了Mtor、Rptor和Irs2的mRNA表达，而Rictor、Prkaa1和Prkaa2的表达未发生变化。在蛋白水平上，丝素蛋白显著提高了p-mTOR/mTOR比值并升高了肌细胞生成素（myogenin）的表达。因此，丝素蛋白通过激活mTOR信号，特别是mTORC1相关通路，促进了C2C12细胞的肌原性分化和肌管成熟。这些发现表明，丝素蛋白可能作为一种功能性成分或生物材料用于改善骨骼肌健康。

研究背景与科学问题

肌肉减少症（sarcopenia）是以年龄相关的骨骼肌质量与功能进行性丧失为特征的疾病，严重影响老年人生活质量。衰老导致肌原性分化（myogenic differentiation）和蛋白质合成能力下降，进而加速肌肉萎缩。雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin, mTOR）信号通路是调控肌发生和蛋白质合成的关键通路，其激活可促进肌细胞生长和肥大，并诱导生肌调节因子如MyoD和肌细胞生成素（myogenin）的表达。然而，能够有效刺激mTOR信号介导的肌原性分化的天然活性物质仍有待发掘。丝素蛋白（silk fibroin）作为家蚕（Bombyx mori）茧的主要成分，具有良好的生物相容性和丰富的氨基酸组成，但其对骨骼肌分化的直接作用及分子机制尚不明确。为此，研究人员开展了本研究，旨在探究丝素蛋白对C2C12小鼠成肌细胞（myoblasts）肌原性分化和肌管（myotube）形成的影响及其通过mTOR信号通路的分子机制。

研究方法概述

研究人员采用酸水解法制备丝素蛋白粉末，并通过游离氨基酸分析仪测定其氨基酸组成。利用C2C12小鼠成肌细胞系作为体外模型，以含2%马血清的分化培养基诱导分化，同时给予不同浓度（25和50 μg/mL）丝素蛋白处理。主要技术方法包括：MTT法检测细胞活力以确定无毒浓度；倒置显微镜观察并测量肌管形态和直径；实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）检测mTOR信号通路相关基因（Mtor、Rptor、Irs2、Rictor、Prkaa1、Prkaa2）的mRNA表达水平；蛋白质印迹法（western blotting）检测mTOR磷酸化水平以及MyoD和肌细胞生成素的蛋白表达水平。

研究结果

丝素蛋白的游离氨基酸组成

丝素蛋白总游离氨基酸含量为46.31 mg/100 g，主要成分为甘氨酸（19.46 mg/100 g）、L-丙氨酸（17.20 mg/100 g）和L-丝氨酸（4.93 mg/100 g），三者合计占总量的90%以上。此外还含有支链氨基酸（BCAAs），包括L-缬氨酸（1.34 mg/100 g）、L-异亮氨酸（0.28 mg/100 g）和L-亮氨酸（0.36 mg/100 g）。

丝素蛋白对C2C12细胞活力的影响

MTT实验结果显示，50和100 μg/mL丝素蛋白处理不影响细胞活力，而250、500和1000 μg/mL浓度则呈剂量依赖性显著降低细胞活力至对照组的77%、55%和26%。据此选择无细胞毒性的25和50 μg/mL进行后续实验。

丝素蛋白对肌原性分化和肌管形成的影响

显微镜观察显示，丝素蛋白处理组在第3天形成更多多核肌管，且肌管更粗更长。定量分析表明，对照组平均肌管直径为9.90 μm，而25和50 μg/mL丝素蛋白处理组分别增至10.82 μm和12.47 μm，其中50 μg/mL组差异具有统计学意义（p<0.01）。

丝素蛋白对mTOR和AMPK相关基因表达的影响

qRT-PCR结果显示，50 μg/mL丝素蛋白处理使Mtor mRNA表达显著升高101倍，Rptor和Irs2分别升高5.8倍和14.3倍。而Rictor、Prkaa1和Prkaa2的表达均无显著变化。这表明丝素蛋白优先调控mTORC1相关信号而非mTORC2，且可能涉及IGF-2/IRS2介导的信号级联，同时不影响腺苷一磷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路。

丝素蛋白对mTOR信号及肌原性蛋白表达的影响

蛋白质印迹分析显示，25和50 μg/mL丝素蛋白处理使p-mTOR/mTOR比值分别显著增加至对照组的2.16倍和2.96倍。MyoD蛋白在25 μg/mL时略有升高，而在50 μg/mL时反而较低。50 μg/mL丝素蛋白显著升高肌细胞生成素蛋白表达至对照组的1.94倍。由于肌细胞生成素是终末分化和肌管成熟的关键调节因子，其表达升高表明丝素蛋白可促进肌原性分化和肌管成熟。

结论与讨论

研究人员指出，丝素蛋白中高含量的甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸及支链氨基酸可能为其生物学效应提供了物质基础。酸水解处理降低了丝素蛋白的分子量并改变了结构特征，可能增强其溶解性和生物活性。与以往主要关注丝素蛋白作为支架或复合材料用于肌肉组织工程的研究不同，本研究首次直接证实了丝素蛋白对C2C12成肌细胞分化的促进作用。研究结论表明，丝素蛋白通过激活mTOR信号，特别是mTORC1相关通路，上调Mtor、Rptor和Irs2的mRNA表达并提高mTOR磷酸化水平和肌细胞生成素表达，从而促进肌原性分化和肌管成熟。这些发现提示丝素蛋白可能具有作为改善骨骼肌健康的功能性成分或生物材料的潜力。但研究人员也强调，本研究的发现仅限于体外C2C12细胞模型，尚需在合适的动物模型中进一步验证其在体内的功效。